新型鴨呼腸孤病毒的鑒定及其全基因組序列解析.pdf

1、2011年上半年,中國(guó)太湖流域的許多養(yǎng)鴨場(chǎng)陸續(xù)發(fā)生一種新的鴨病毒性傳染病,臨床主要表現(xiàn)為發(fā)病雛鴨精神萎靡,軟腳,排白色稀糞,發(fā)病率約40％,病率在35%-40%以上,給養(yǎng)鴨業(yè)造成了較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　為了分離該病的病原,我們從太湖發(fā)病鴨場(chǎng)采集發(fā)病鴨實(shí)質(zhì)臟器,通過接種SPF雞胚進(jìn)行病毒分離。結(jié)果從雞胚尿囊液中分離到一株病毒,經(jīng)測(cè)定該病毒尿囊液的ELD50為105.5/0.2mL。將該病毒尿囊液感染1日齡櫻桃谷肉鴨可復(fù)制出與臨床

2、相同的癥狀,且可從發(fā)病鴨的脾臟和肝臟中分離到病毒,該結(jié)果表明我們分離到的病毒為造成這次疾病發(fā)生的病原。通過PCR、RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)該病毒進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果排除了所有常見的或者是具有地方流行特點(diǎn)的鴨病毒性傳染病,包括鴨病毒性腸炎病毒、鴨肝炎病毒、禽流感病毒、鴨黃病毒、鴨細(xì)小病毒和番鴨呼腸孤病毒。
　　為了確定該病毒的分類學(xué)地位,首先,我們通過病毒核酸類型的鑒定、有機(jī)溶劑敏感性試驗(yàn)和血凝性試驗(yàn)證明該病毒為RNA病毒、無囊膜、不具有雞

3、血紅細(xì)胞凝集活性。然后,將病毒尿囊液經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化進(jìn)行電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)該病毒粒子直徑約70nm、呈球形、正二十面體對(duì)稱和雙層衣殼結(jié)構(gòu),病毒具有典型的正呼腸孤病毒科成員的特性。最后,我們參考番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)89026株S2基因的部分序列設(shè)計(jì)合成了一對(duì)引物,對(duì)該病毒的核酸序列進(jìn)行了測(cè)定,同時(shí)對(duì)該序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析,結(jié)果表明該病毒與2009年從福建分離到的新型鴨呼腸孤病毒(Duck

4、 reovirus,DRV)NP03株親緣關(guān)系很近處在同一進(jìn)化分支,而與番鴨呼腸孤病毒親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。至此,我們分離并鑒定出造成鴨群中這次疫病流行的病原為新型鴨源呼腸孤病毒。根據(jù)國(guó)際命名規(guī)則,將該病毒命名為新型鴨呼腸孤病毒太湖2011株(DRVTH11)。
　　為了了解該病毒的增殖特性,我們將病毒感染BHK-21細(xì)胞系,對(duì)其一步生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了測(cè)定。研究表明DRVTH11株病毒可在BHK-21細(xì)胞系上增殖,出現(xiàn)細(xì)胞巨融合病變,通過WB

5、、IFA方法均能在細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到該病毒的存在。一步生長(zhǎng)曲線顯示,該毒株感染BHK-21細(xì)胞后0-12h為潛伏期,12h后開始增殖,12-36h進(jìn)入快速增殖期,48h病毒滴度即達(dá)到最高,TCID50為106.57/0.1mL,隨后病毒的增殖隨細(xì)胞的崩解而降低。
　　為了了解該病毒分子遺傳信息,我們通過RT-PCR方法對(duì)病毒基因組進(jìn)行擴(kuò)增,成功獲得覆蓋DRVTH11株病毒全基因組的若干目的片段克隆。序列拼接后顯示病毒基因組全長(zhǎng)為23,4

6、18bp,病毒基因組有十個(gè)基因片段組成,大小如下:L1,3958bp;L2,3829bp;L3,3907bp;M1,2283bp;M2,2158bp;M3,1996bp;S1,1568bp;S2,1326bp;S3,1202bp;S4,1191bp。與呼腸孤病毒科其他成員一樣,該病毒每個(gè)基因片段在5'末端和3'末端均存在保守序列,為5'-GCUUUUU和3'-UCAUC。其中除了S1節(jié)段含有三個(gè)ORF以外,每個(gè)節(jié)段只含有一個(gè)完整的ORF

7、,所以推測(cè)病毒基因組至少編碼12個(gè)蛋白。
　　為了明確DRVTH11株病毒與其他禽源呼腸孤病毒之間的同源性關(guān)系,我們分別挑選了MDRV代表株89026株和雞源呼腸孤病毒(Avian orthoreovirus,ARV)代表株S1133株進(jìn)行基因組同源性分析。結(jié)果顯示,DRVTH11株病毒M1、M3、S2、S4基因片段與MDRV的核苷酸同源性較高為81.8%-87.8%,M2、S3基因片段同源性較低為68.5%和69.8%,S1基因

8、片段同源性最低僅為34.4%;該病毒基因組與ARV的核苷酸同源性均較低為69.0%-79.2%,其中S1片段與ARV核苷酸同源性僅為46.3%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),整個(gè)基因組中S1片段變異最顯著:DRVTH11株病毒S1片段長(zhǎng)為1568bp,MDRV為1124bp,ARV為1643bp;其中MDRV僅編碼兩個(gè)蛋白(p10、σC),而ARV與DRVTH11均編碼三個(gè)蛋白(p10、p17、σC),DRVTH11株編碼的這三個(gè)蛋白與ARV、MDR

9、V對(duì)應(yīng)氨基酸同源性均很低,分別為12.5%和28.6%、26.5%、25.2%和40.0%。這一結(jié)果表明,DRVTH11株病毒為區(qū)別于ARV和MDRV的新型鴨呼腸孤病毒。
　　為了進(jìn)一步了解該病毒與MDRV和ARV之間的進(jìn)化關(guān)系,我們分別挑選了σC基因序列和μB基因序列進(jìn)行分子進(jìn)化分析。首先,通過對(duì)σC基因和μB基因繪制進(jìn)化樹,我們發(fā)現(xiàn):可將禽源呼腸孤病毒劃分為3個(gè)不同的進(jìn)化群,ARV、MDRV和DRV分別處在不同的分支,應(yīng)為三種

10、不同的病毒。其次,通過σC基因繪制的進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn):DRVTH11株與MDRV親緣關(guān)系更近,共同構(gòu)成一個(gè)主干支,ARV單獨(dú)處在另一個(gè)主干支;同時(shí),通過對(duì)μB基因繪制進(jìn)化樹我們發(fā)現(xiàn):DRVTH11株病毒卻與ARV親緣關(guān)系較近,共同構(gòu)成一個(gè)主干枝,而MDRV則處在另一個(gè)主干枝。這一結(jié)果提示我們,該病毒的不同基因片段的進(jìn)化來源不同,并非單純的由ARV或是MDRV進(jìn)化而來,可能是由MDRV和ARV病毒在同一宿主中發(fā)生了基因重排而進(jìn)化產(chǎn)生,這一推理仍