新城疫病毒M蛋白功能結(jié)構(gòu)域突變以及M蛋白與細(xì)胞核磷蛋白B23互作影響病毒復(fù)制的分子機(jī)制.pdf

1、ThemolecularmechanismoftheeffectsoffunctionaldomainsmutationintheMproteinandtheinteractionofMproteinwithcellularnucleolarphosphoproteinB23onthereplicationofNewcastlediseasevirusADissertationSubmittedinPartialFulfillmento

2、ftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofPhilosophy1nPreventiveVeterinaryMedicineCollegeofVeterinaryMedicineYangzhouUniversityYangzhou，PRChinaPhDcandidate：ZhiqiangDuanAdvisor：ProfXiufanLiuMay2014II揚(yáng)州大學(xué)博士學(xué)位論文白NES中關(guān)鍵疏水性氨基酸的鑒定

3、結(jié)果表明，3個(gè)NES的最后2個(gè)疏水性氨基酸在NES介導(dǎo)的核輸出能力中起關(guān)鍵作用，而且這些關(guān)鍵氨基酸在不同基因型NDVM蛋白中均保守。此外，將M蛋白NES進(jìn)行單個(gè)或聯(lián)合突變，發(fā)現(xiàn)單個(gè)或2個(gè)NES聯(lián)合突變不影響M蛋白細(xì)胞質(zhì)定位，而3個(gè)NES聯(lián)合突變則導(dǎo)致M蛋白由細(xì)胞質(zhì)定位變?yōu)榧?xì)胞核定位。在此過程中，使用出核轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑LeptomycinB均不影響NES突變前后M蛋白亞細(xì)胞定位。我們的結(jié)果說明，NDVM蛋白中存在3個(gè)NES共同決定M蛋白的細(xì)胞

4、質(zhì)定位，而且3個(gè)NES介導(dǎo)的M蛋白核輸出途徑是CRMl非依賴的。2新城疫病毒M蛋白FPIV晚期結(jié)構(gòu)域突變影響病毒的復(fù)制和出芽本研究根據(jù)其它副黏病毒M蛋白中已報(bào)道的晚期結(jié)構(gòu)域，將NDVZJl株M蛋白氨基酸序列與之進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)NDVM蛋白中存在與人副流感病毒5型和腮腺炎病毒M蛋白相似的FPIV晚期結(jié)構(gòu)域。以NDVZJl株全長cDNA克隆質(zhì)粒pNDV／ZJl為骨架構(gòu)建M蛋白點(diǎn)突變?nèi)L質(zhì)粒，利用反向遺傳學(xué)技術(shù)，我們成功拯救出FPIV點(diǎn)突變

5、的四株病毒。病毒在雞胚和細(xì)胞中的復(fù)制能力測(cè)定結(jié)果顯示，四株突變病毒能在雞胚中穩(wěn)定繁殖，但F或P突變的病毒在雞胚和細(xì)胞中的復(fù)制能力顯著下降。同時(shí)，病毒生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明，F(xiàn)或P突變導(dǎo)致病毒的MDT(分別為102h和84h)與親本病毒(54h)相比明顯延長，并且ICPI測(cè)定值(分別為164和170)與親本病毒(189)相比也明顯下降，說明F或P突變能降低病毒的復(fù)制能力和致病性。此外，病毒出芽效率測(cè)定結(jié)果顯示，F(xiàn)或P突變導(dǎo)致病毒在DF1細(xì)

6、胞中的出芽效率顯著降低，而且影響M蛋白與病毒出芽相關(guān)細(xì)胞蛋白VPS4A的結(jié)合。我們的結(jié)果說明，NDVM蛋白中的FPIV基序是病毒出芽必需的晚期結(jié)構(gòu)域，而FPIV晚期結(jié)構(gòu)域中的氨基酸F和P對(duì)病毒復(fù)制、致病力以及出芽過程起關(guān)鍵作用。同時(shí)，NDV的出芽過程需要依賴宿主細(xì)胞內(nèi)多泡體蛋白分選途徑。3新城疫病毒M蛋白R(shí)42A突變影響M蛋白細(xì)胞核定位并且降低病毒的復(fù)制和致病性NDVM蛋白是一種具有高度堿性、疏水性但不跨膜的病毒蛋白。對(duì)M蛋白電荷分布分

7、析發(fā)現(xiàn)，M蛋白N端前100位氨基酸總體呈酸性，僅含有個(gè)別堿性氨基酸。本研究對(duì)NDVZJl株M蛋白N端前100位氨基酸中的堿性氨基酸進(jìn)行突變，以觀察點(diǎn)突變對(duì)M蛋白亞細(xì)胞定位的影響，并通過反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救點(diǎn)突變病毒，進(jìn)一步研究突變對(duì)病毒復(fù)制和致病性的影響。結(jié)果顯示，M蛋白第42位堿性氨基酸R突變?yōu)锳后，導(dǎo)致M蛋白由細(xì)胞核和核仁定位變?yōu)榧?xì)胞質(zhì)定位，但是不影響M蛋白與病毒NP蛋白和FIN蛋白的相互作用。將NDV與其它副黏病毒M蛋白氨基酸序列進(jìn)