ClassⅠ新城疫病毒9a5b株反向遺傳技術(shù)平臺(tái)的初步建立.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，嚴(yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)，已造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。NDV屬于副粘病毒科、副粘病毒亞科、禽腮腺炎病毒屬，基因組是不分節(jié)段、單股負(fù)鏈RNA。目前己報(bào)道的大多數(shù)強(qiáng)毒分離株均屬于ClassⅡ，而ClassⅠ中大部分是低致病力的弱毒株(1oNDV)或無(wú)毒株，這些1oNDV普遍存在于各種家禽

2、和野鳥(niǎo)體內(nèi)，但是由于ClassⅠ毒株宿主具有高度遷徙的特點(diǎn)，極易導(dǎo)致NDV由野鳥(niǎo)或水禽向家禽中轉(zhuǎn)移，進(jìn)而演化為臨床致病性強(qiáng)毒。本室研究員于圣青實(shí)驗(yàn)證實(shí)，野生健康水禽的攜帶非致病性NDV毒株，經(jīng)9次SPF雞體內(nèi)氣囊傳代(9a)和5次腦內(nèi)傳代(5b)后，能夠逐漸突變?yōu)樗侔l(fā)型NDV，命名為9a5b。本室已對(duì)親本病毒和各代次突變株進(jìn)行了進(jìn)行全基因組測(cè)序，并初步研究了它的一些生物學(xué)特性。為了從分子水平上進(jìn)一步研究ClassⅠ NDV的遺傳進(jìn)化機(jī)制

3、，本研究構(gòu)建了含有此毒株的NP、P與L基因的三個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒，利用微型基因組對(duì)三個(gè)表達(dá)質(zhì)粒的功能進(jìn)行了鑒定；根據(jù)全基因組序列設(shè)計(jì)引物分段克隆，構(gòu)建此病毒的全基因組cDNA克??；將全基因組cDNA克隆和三個(gè)輔助質(zhì)粒按照不同的比例分別共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，摸索ClassⅠ NDV拯救的條件，目前ClassⅠ NDV仍沒(méi)有成功拯救的報(bào)道，此研究旨在試圖建立ClassⅠ NDV的反向遺傳技術(shù)平臺(tái)，以便于利用此平臺(tái)進(jìn)行ClassⅠ NDV的

4、功能基因組研究和探索新型疫苗的研發(fā)。
　　 1.ClassⅠ新城疫病毒9aSb株NP、P和L輔助質(zhì)粒的構(gòu)建及功能鑒定
　　 根據(jù)Genbank已發(fā)表的9a5b株的全基因組序列，設(shè)計(jì)了5對(duì)引物，經(jīng)RT-PCR從9a5b株NDV尿囊液中擴(kuò)增目的片段，分別克隆入pGEMT-easy載體中。將引物NP、P的擴(kuò)增片段連入pGEMT-easy載體，利用兩端設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)連入同樣限制酶酶切的真核表達(dá)載體pCI-neo中，得到表達(dá)質(zhì)粒p

5、CI-NP、pCI-P，并測(cè)序鑒定。將引物L(fēng)1、L2、L3擴(kuò)增的片段連入pGEMT-easy載體，利用兩端設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)分別連入同樣限制酶酶切的真核表達(dá)載體pCI-neo中，得到表達(dá)質(zhì)粒pCI-L，并測(cè)序鑒定。
　　 將本室于洋構(gòu)建的9a5b株微型基因組(Mini-genome)TVT-LGT和以上構(gòu)建的三個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在倒置顯微鏡下能看到明顯的特異性綠色熒光，說(shuō)明構(gòu)建的三個(gè)輔助質(zhì)粒能夠正確表達(dá)相

6、應(yīng)蛋白，形成核糖核蛋白復(fù)合物(RNPs)，完成基因組的復(fù)制和病毒基因的轉(zhuǎn)錄。
　　 2.ClassⅠ新城疫病毒9a5b株全基因組cDNA的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 根據(jù)已上傳Genbank的9a5b株全基因組序列，本研究將全長(zhǎng)cDNA分為A1、A2、A3、B1、B2、B36段分別進(jìn)行克隆。設(shè)計(jì)6對(duì)引物，RT-PCR擴(kuò)增6個(gè)片段，分別連入pGEM T easy載體。T-B3和T-B2用SalⅠ和BssHⅡ酶切后進(jìn)行體外連接得到

7、質(zhì)粒T-B2B3。用SacⅡ酶切T-B283和T-B1，酶切產(chǎn)物去磷酸化處理后連接獲得質(zhì)粒T-B1B2B3。取T-B1B2B3和TVT-3'5'陽(yáng)性質(zhì)粒用SpeⅠ酶切，酶切產(chǎn)物去磷酸化處理后連接為T(mén)VT-B。T-A1和T-A2用SalⅠ和HindⅢ酶切后連接為T(mén)-A1-A2。T-A1-A2用EagⅠ酶切，TVT-3’5’經(jīng)EagⅠ酶切并用CIAP進(jìn)行去磷酸化后連接為T(mén)VT-A1-A2。PCR2.1T-A3經(jīng)StuⅠ和SacⅠ酶切和TVT

8、-3'5'連接為A3-TVT。TVT-A1-A2和A3-TVT用SacⅠ和MluⅠ酶切后連接為T(mén)VT-A。TVT-B和TVT-A用SalⅠ和AgeⅠ酶切后連接為全長(zhǎng)質(zhì)粒TVT-BA。酶切鑒定陽(yáng)性的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定連接正確，沒(méi)有出現(xiàn)突變、缺失或非模板序列插入。
　　 3.ClassⅠ新城疫病毒9a5b株的拯救條件的探索
　　 將NDV9a5b株全基因組cDNA克隆和含9a5b株NP、P、L基因的輔助質(zhì)粒按不同比例共轉(zhuǎn)染BSR

9、-T7/5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h，60h，72h收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其上清接種SPF雞胚。將不同的轉(zhuǎn)染樣品接種后死亡雞胚尿囊液，HA效價(jià)檢測(cè)為28。三次雞胚傳代后，尿囊液的HA效價(jià)均為28，全基因組測(cè)序也正確。這說(shuō)明病毒能夠成功拯救。重復(fù)拯救實(shí)驗(yàn)，病毒依然能夠拯救成功。
　　 全文小結(jié)：
　　 (1)應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得了9a5b株NDV NP、P、L基因，分別構(gòu)建了3種病毒復(fù)制必須的的真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 (2)

10、利用9a5b株的微型基因組對(duì)所構(gòu)建的三個(gè)表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行了功能檢測(cè)，證明能夠正常啟動(dòng)病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。
　　 (3)根據(jù)全基因序列設(shè)計(jì)引物分段克隆，利用適合的酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接，獲得9a5b株全基因組cDNA轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒。
　　 (4)初步探索9a5b株的反向遺傳拯救的體系，將不同的轉(zhuǎn)染產(chǎn)物接種雞胚，接種的雞胚大約在40h左右死亡，尿囊液HA效價(jià)為28，三次雞胚傳代后，尿囊液HA效價(jià)均為28，說(shuō)明病毒可以成功拯救。將病毒拯救實(shí)驗(yàn)重