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文檔簡(jiǎn)介
1、2001年首次報(bào)道Viperin是一種受干擾素、病毒等刺激誘導(dǎo)的基因。近年來(lái),已經(jīng)證實(shí)Viperin不僅能被多種因素誘導(dǎo)而大量表達(dá),而且還具有廣譜的抗病毒和抗細(xì)菌等作用,甚至還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路的功能。由此可見(jiàn),Viperin在天然免疫中發(fā)揮非常重要的角色。隨著對(duì)Viperin的深入和全面研究,逐漸揭示Viperin的抗多種不同病毒、抗細(xì)菌等作用機(jī)制。本研究從長(zhǎng)白鴨的外周淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增鴨Viperin基因并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行詳
2、盡地基因分析?;赩iperin參與抗病毒作用,通過(guò)鴨Viperin蛋白抗NDV的試驗(yàn)研究,以揭示鴨Viperin抗NDV的分子機(jī)制。
本研究首先采集鴨抗凝血并分離其外周血淋巴細(xì)胞,然后將外周淋巴血細(xì)胞提取鴨的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)已公布的鴨的全基因組中RSAD2序列(登錄號(hào)NW_004676922.1以及XM005018580.1)設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物,最終獲得了鴨Viperin ORF序列。根據(jù)獲得的鴨Viperin
3、基因序列,使用生物信息學(xué)軟件對(duì)擴(kuò)增的鴨Viperin序列進(jìn)行詳盡的功能分析。結(jié)果表明,鴨Viperin的蛋白結(jié)構(gòu)與其它已公布物種的Viperin蛋白非常相似,都包括N端區(qū)域、中心區(qū)域和C端區(qū)域。
根據(jù)Viperin的基因序列,將Viperin基因克隆到pGEX4T-1原核表達(dá)載體,分別利用原核表達(dá)方法表達(dá)并純化Viperin的融合蛋白。將該融合蛋白免疫1月齡家兔,檢測(cè)血清抗體水平,成功制備出兔抗Viperin的血清。早期研究已
4、證實(shí)多種病毒可誘導(dǎo)Viperin的表達(dá),于是我們開(kāi)展鴨Viperin在體內(nèi)體外水平的表達(dá)分析。一方面,通過(guò)制備并培養(yǎng)鴨的原代胚胎細(xì)胞(DEF),利用不同劑量poly(I:C)和NDV感染DEF后檢測(cè)Viperin的表達(dá)。結(jié)果表明,poly(I:C)和NDV均能刺激誘導(dǎo)Viperin的表達(dá)。另一方面,以2周齡長(zhǎng)白鴨的為動(dòng)物材料,使用用NDV感染鴨來(lái)檢測(cè)Viperin在不同臟器的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn),正常生理情況下,不同臟器的Viperin含量具
5、有較大的差異,Viperin主要分布于血液,其次是肺臟和脾臟,腎臟和肌肉較低;以對(duì)照組相比,在NDV感染后,不同臟器Viperin的表達(dá)都有不同程度的增加。該結(jié)果表明,NDV在細(xì)胞水平和鴨體上均能夠增強(qiáng)Viperin表達(dá)。
為了進(jìn)一步確定鴨Viperin發(fā)揮抗病毒的關(guān)鍵區(qū)域,我們構(gòu)建了Viperin的缺失片段(包括N端和C端缺失,分別命名為VipΔN和VipΔC)以及設(shè)計(jì)抑制鴨Viperin表達(dá)的siRNA序列。將鴨的Vipe
6、rin基因(Viperin,VipΔN和VipΔC)克隆到pCAGGS真核表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞;利用siRNA技術(shù),轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒于DEF細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)后使用NDV感染DEF,在感染后不同時(shí)間內(nèi)收集樣品以檢測(cè)NDV的病毒復(fù)制情況。結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)鴨Viperin的情況下,能顯著的抑制NDV感染,試驗(yàn)組的NDV滴度明顯低于對(duì)照組;轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒后能抑制Viperin的表達(dá),并有利于NDV復(fù)制。另外,從過(guò)表達(dá)鴨VipΔ
7、N和VipΔC結(jié)果看,截短體的抗病毒作用已經(jīng)顯著降低,N端缺失后的Viperin還具有有限的抗病毒作用,而C端缺失后則導(dǎo)致Viperin抗病毒作用的完全喪失。這表明,Viperin的C端區(qū)域是其發(fā)揮抗病毒作用的關(guān)鍵區(qū)域。
綜上所述,本研究研究了鴨Viperin基因的生物特性和探究該蛋白的生物學(xué)功能,發(fā)現(xiàn)poly(I:C)和NDV等因素均能誘導(dǎo)Viperin的表達(dá),說(shuō)明鴨Viperin與其它物種Viperin具有類似的特征;Vi
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