鴨Viperin蛋白抗新城疫病毒機(jī)制的初步研究.pdf

1、2001年首次報(bào)道Viperin是一種受干擾素、病毒等刺激誘導(dǎo)的基因。近年來(lái)，已經(jīng)證實(shí)Viperin不僅能被多種因素誘導(dǎo)而大量表達(dá)，而且還具有廣譜的抗病毒和抗細(xì)菌等作用，甚至還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)通路的功能。由此可見(jiàn)，Viperin在天然免疫中發(fā)揮非常重要的角色。隨著對(duì)Viperin的深入和全面研究，逐漸揭示Viperin的抗多種不同病毒、抗細(xì)菌等作用機(jī)制。本研究從長(zhǎng)白鴨的外周淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增鴨Viperin基因并利用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行詳

2、盡地基因分析?；赩iperin參與抗病毒作用，通過(guò)鴨Viperin蛋白抗NDV的試驗(yàn)研究，以揭示鴨Viperin抗NDV的分子機(jī)制。
　　本研究首先采集鴨抗凝血并分離其外周血淋巴細(xì)胞，然后將外周淋巴血細(xì)胞提取鴨的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)已公布的鴨的全基因組中RSAD2序列（登錄號(hào)NW_004676922.1以及XM005018580.1）設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物，最終獲得了鴨Viperin ORF序列。根據(jù)獲得的鴨Viperin

3、基因序列，使用生物信息學(xué)軟件對(duì)擴(kuò)增的鴨Viperin序列進(jìn)行詳盡的功能分析。結(jié)果表明，鴨Viperin的蛋白結(jié)構(gòu)與其它已公布物種的Viperin蛋白非常相似，都包括N端區(qū)域、中心區(qū)域和C端區(qū)域。
　　根據(jù)Viperin的基因序列，將Viperin基因克隆到pGEX4T-1原核表達(dá)載體，分別利用原核表達(dá)方法表達(dá)并純化Viperin的融合蛋白。將該融合蛋白免疫1月齡家兔，檢測(cè)血清抗體水平，成功制備出兔抗Viperin的血清。早期研究已

4、證實(shí)多種病毒可誘導(dǎo)Viperin的表達(dá)，于是我們開(kāi)展鴨Viperin在體內(nèi)體外水平的表達(dá)分析。一方面，通過(guò)制備并培養(yǎng)鴨的原代胚胎細(xì)胞(DEF)，利用不同劑量poly(I:C)和NDV感染DEF后檢測(cè)Viperin的表達(dá)。結(jié)果表明，poly(I:C)和NDV均能刺激誘導(dǎo)Viperin的表達(dá)。另一方面，以2周齡長(zhǎng)白鴨的為動(dòng)物材料，使用用NDV感染鴨來(lái)檢測(cè)Viperin在不同臟器的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常生理情況下，不同臟器的Viperin含量具

5、有較大的差異，Viperin主要分布于血液，其次是肺臟和脾臟，腎臟和肌肉較低;以對(duì)照組相比，在NDV感染后，不同臟器Viperin的表達(dá)都有不同程度的增加。該結(jié)果表明，NDV在細(xì)胞水平和鴨體上均能夠增強(qiáng)Viperin表達(dá)。
　　為了進(jìn)一步確定鴨Viperin發(fā)揮抗病毒的關(guān)鍵區(qū)域，我們構(gòu)建了Viperin的缺失片段（包括N端和C端缺失，分別命名為VipΔN和VipΔC）以及設(shè)計(jì)抑制鴨Viperin表達(dá)的siRNA序列。將鴨的Vipe

6、rin基因（Viperin，VipΔN和VipΔC）克隆到pCAGGS真核表達(dá)載體上并轉(zhuǎn)染DEF細(xì)胞;利用siRNA技術(shù)，轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒于DEF細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)后使用NDV感染DEF，在感染后不同時(shí)間內(nèi)收集樣品以檢測(cè)NDV的病毒復(fù)制情況。結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)鴨Viperin的情況下，能顯著的抑制NDV感染，試驗(yàn)組的NDV滴度明顯低于對(duì)照組;轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒后能抑制Viperin的表達(dá)，并有利于NDV復(fù)制。另外，從過(guò)表達(dá)鴨VipΔ

7、N和VipΔC結(jié)果看，截短體的抗病毒作用已經(jīng)顯著降低，N端缺失后的Viperin還具有有限的抗病毒作用，而C端缺失后則導(dǎo)致Viperin抗病毒作用的完全喪失。這表明，Viperin的C端區(qū)域是其發(fā)揮抗病毒作用的關(guān)鍵區(qū)域。
　　綜上所述，本研究研究了鴨Viperin基因的生物特性和探究該蛋白的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)poly(I:C)和NDV等因素均能誘導(dǎo)Viperin的表達(dá)，說(shuō)明鴨Viperin與其它物種Viperin具有類似的特征;Vi