反向遺傳技術研究新城疫病毒P基因功能及其對病毒毒力的影響.pdf

1、新城疫(Newcastledisease，ND)是一種嚴重的傳染性疾病，能夠感染多種禽類，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。測定了鵝源NDV強毒株ZJ1的全基因組序列，并在此基礎上構建了該基因組cDNA的全長克隆以及分別表達該毒株NP、P以及L蛋白的3個真核表達質粒，通過病毒的體外包裝技術，拯救出了具有感染性的病毒粒子，成功建立了鵝源NDV的反向遺傳操作技術平臺，這也為從病毒生物學特性的角度研究P基因提供了技術支持。 1.基因III

2、型和IX型新城疫病毒全基因組測序及其在新城疫進化史中的重要地位分析 根據(jù)EMBL/GenBank中已發(fā)表的基因III型NDV全基因和基因IX型NDV基因片段設計一套全基因引物，將NDV全基因分為10個相互重疊的片段進行RT-PCR擴增。PCR產(chǎn)物連入pGEM-Teasy載體測序后應用DNAStar軟件進行遺傳進化分析。我們測定了5株基因IX型NDV和2株基因III型全基因組序列并進行遺傳進化分析。實驗數(shù)據(jù)顯示，雖然兩種基因型毒株

3、同源性較高，但是基因IX型NDVNP基因內確實存在6nt插入片段，基因全長為15，192nt，是與基因III型NDV不同的毒株。鑒于基因IX型代表株F48E8的分離時間，可以確定早在上世紀三、四十年代就已經(jīng)存在全長15，192nt的毒株。值得注意的是，常用的遺傳進化分析以及限制性內切酶位點(RE)分析并不能有效的區(qū)分這兩種基因型以及IV型，NP基因5’端非編碼區(qū)核苷酸長度才是最可靠的遺傳標志。最后，根據(jù)兩個基因型毒株相近的分離時間和高度

4、的同源性，我們推測最早有一群NDV毒株在遺傳進化過程中分化為兩支，保持15，186nt基因組長度的一支演變?yōu)榛騃II型、IV型及相關毒株；而另外一支，在NP基因5’-NCR插入6個核苷酸，產(chǎn)生了15，192nt基因組長度的毒株，可能即為最早的基因IX型毒株，再逐步進化演變?yōu)楹髞淼幕騐～VIII型。 2.新城疫病毒P/V/W基因編碼產(chǎn)物的結構域分析及針對V蛋白C端結構域的抗體制備 根據(jù)EMBL/GenBank上發(fā)布的N

5、DV基因序列，分別設計針對基因II、III、VI和VII型以及classINDV毒株P基因的引物。RT-PCR擴增后測序，從而獲得5種基因型NDVP基因的正確序列。通過核苷酸序列預測P基因表達產(chǎn)物的氨基酸序列，并進行二級結構預測和三級結構模擬。實驗結果發(fā)現(xiàn)，腮腺炎病毒屬的猴副流感病毒V型(Simianvirus5，SV5)的V蛋白與NDVV蛋白的氨基酸序列同源性以及二級結構的相似性均較高，可以將其空間結構作為模板模擬NDVV蛋白以及P蛋

6、白N端的空間結構。綜合各種分析數(shù)據(jù)，可以確定P蛋白輔助N蛋白折疊的結構域位于N端前50aa內，其中20aa-29aa預測為一個潛在的疏水性α-螺旋；50aa-131aa結構紊亂；預測P蛋白螺旋卷曲結構位于221aa-290aa范圍內，可能介導了P蛋白四聚體的形成以及與L蛋白的相互作用：預測NDV的X結構域位于291aa-392aa范圍內，其中350aa-392aa區(qū)域內存在3個相連的α-螺旋，其二級結構與副粘病毒X結構域的C端亞單位結構

7、相似，可能介導了P蛋白與衣殼化基因組的相互作用。V蛋白的C端結構域(C-terminaldomain，CTD)的編碼區(qū)域位于P蛋白132aa-239aa區(qū)域內，與螺旋卷曲結構部分重疊。最后，根據(jù)分析結果將基因VII型NDV毒株ZJ1V蛋白CTD的序列插入pGEX-6p-1表達載體中誘導表達。表達產(chǎn)物通過切膠免疫的方法多次免疫小鼠，結果獲得抗V蛋白CTD的多抗血清。利用間接免疫熒光鑒定多抗血清與病毒蛋白的反應情況，證明制備的抗CTD血清能

8、夠與NDV感染vero細胞作用，與正常Vero細胞不反應，為后續(xù)的研究工作奠定了基礎。 3.不同基因型新城疫病毒P基因對病毒毒力的影響 利用BglII酶切全長質粒pNDV/ZJ1，成功構建含有TVT載體、NP基因、P基因以及很少部分M基因和L基因片段的中間質粒pTX37。PCR分別分別擴增NDV基因II型疫苗株LaSota、基因III型中等毒力株JS/05/9/Go和基因VII型強毒株JS/05/5/Go的P基因，上游引

9、物突變引入SmaI的酶切位點，下游引物突變出ApaI酶切位點。通過SmaI和ApaI將3株病毒的P基因替換進入中間載體pTX37，再利用Bst217I和XbaI將重組質粒連入NDV基因組全長轉錄載體質粒。重組的3種NDV基因組全長轉錄載體質粒與3個輔助表達質粒pCI-L、pCI-NP和pCI-P共轉染BSR-T7/5細胞，成功拯救出了P基因替換株RZJ-LP，RZJ-4P，RZJ-IP。通過MDT、ICPI、IVPI、細胞致病力以及生長

10、曲線的檢測，發(fā)現(xiàn)3株P基因替換株的毒力變現(xiàn)明顯的差異：RZJ-LP和RZJ-4P在細胞上的生長滯后于親本病毒ZJ1，細胞上清中的病毒含量比ZJ1低10倍左右；RZJ-4P和RZJ-LP的ICPI從ZJ1的2.54下降至2.33和1.51；RZJ-IP表現(xiàn)出了比ZJ1更強的感染力，感染細胞后最早出現(xiàn)病變的時間和完全破壞單層細胞的時間比ZJ1還要早12h-24h。3株P基因替換株的毒力強弱排序與其P基因來源毒株的毒力強弱排序相同，表明P基因

11、是影響NDV毒力的因素之一。 4.新城疫病毒P基因編碼產(chǎn)物的結構域對病毒生物學活性的影響 通過SmaI和ApaI的酶切位點，將基因II型疫苗株LaSotaP基因RNA編輯位點上游部分和下游部分分別替換進入基因VII型NDVZJ1，成功拯救了具有嵌合P基因的兩株重組病毒RZJ-LaN和RZJ-LaC。通過PCR在中間質粒pTX37的P基因RNA編輯位點后進行點突變引入終止密碼子TAG，拯救V蛋白C端結構域缺失株RZJ-VS

12、和熒光標記的RZJ-VS/GFP，重組病毒P蛋白的正常表達不受影響，而由+1GmRNA編碼的V蛋白翻譯到RNA編輯位點后即終止。通過MDT、ICPI、IVPI、細胞致病力以及生長曲線的檢測，發(fā)現(xiàn)RZJ-LaN和RZJ-LaC的毒力比親本病毒稍弱，但明顯強于P基因替換株RZJ-LP，表明上一章中發(fā)現(xiàn)的RZJ-LP毒力大幅度下降是由P蛋白和V蛋白的多個結構域協(xié)同作用的結果，并非是單個結構域導致。在沒有干擾素系統(tǒng)的Vero細胞上RZJ-LP、

13、RZJ-LaN和RZJ-LaC生長曲線基本重合，而在原代細胞CEF、GEF上RZJ-LaN的增殖能力最強，RZJ-LaC最弱，RZJ-LaN感染細胞中病毒的最高含量比RZJ-LP高5～10倍，RZJ-LP比RZJ-LaC高5～10倍，表明ZJ1V蛋白CTD的干擾素拮抗能力強于LaSota。V蛋白缺失株的生物學活性與相關報道完全相反，在細胞和雞胚中的生長不受影響，接種Vero、CEF和GEF細胞以后，細胞病變以圓縮脫落為主，單層細胞完全破

14、環(huán)的時間超過72h。這種細胞病變過程與親本病毒完全不同，暗示V蛋白的CTD結構域應該具有未知的功能。檢測熒光發(fā)現(xiàn)，RZJ-VS/GFP和RZJ/GFP在以0.01MOI接種細胞后12h都出現(xiàn)了很強的熒光，24h后絕大多數(shù)單層細胞出現(xiàn)熒光，這表明ZJ1株的復制和傳播能力非常的強，感染速度超過了細胞抗病毒免疫啟動的速度，推測基因VII型NDV高效的增殖和傳播能力也是其免疫逃避的機制之一 全文小結： (1)測定了2株基因III

15、型和5株基因IX型NDV的全基因組序列，證實兩種基因型毒株雖然同源性較高，但是基因IX型NDV確實有6nt插入片段，基因全長為15，192nt，是最早出現(xiàn)的15，192nt基因組長度毒株。分析后推測，NDV毒株在遺傳進化過程中分化為兩支，保持15，186nt基因組長度的一支演變?yōu)榛騃II型、IV型及相關毒株；而另外一支，在NP基因中插入6個核苷酸，產(chǎn)生了15，192nt基因組長度的毒株，可能即為最早的基因IX型毒株，再逐步進化演變?yōu)楹?/p>

16、來的基因V～VIII型。 (2)通過對P基因表達產(chǎn)物的生物信息學分析，確定P蛋白和V蛋白結構域的大致位置。 (3)通過反向遺傳平臺，替換基因VII型強毒ZJ1的P基因全基因或部分結構域，成功拯救5株重組病毒。3株P基因替換株的毒力強弱排序與其P基因來源毒株的毒力強弱排序相同，證實P基因是影響毒力的因素之一，同時發(fā)現(xiàn)P基因對毒力的影響是由多個結構域共同參與，而非單一結構域決定。 (4)利用反向遺傳平臺，成功拯救2株