馬鈴薯塊莖低溫糖化機理及轉化酶抑制子基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、馬鈴薯是世界第四大糧食作物，用途廣泛，其加工產(chǎn)品薯片和炸薯條是風靡全球的食品。為了抑制常溫貯藏產(chǎn)生的塊莖失水皺縮、病害傳播、發(fā)芽等現(xiàn)象及延長加工周期，常將馬鈴薯塊莖貯藏在低溫條件下。但低溫常使塊莖中的淀粉加速轉化為還原糖，高溫油炸加工時，還原糖與塊莖中游離的氨基酸發(fā)生反應，嚴重影響炸片或炸條的色澤和品質。塊莖“低溫糖化”是個復雜的數(shù)量性狀，涉及淀粉—糖代謝的多種路徑，調(diào)節(jié)和反饋因子多，因此“低溫糖化”的機理研究是馬鈴薯加工品質改良的重要

2、基礎工作。本研究擬探索不同溫度貯藏條件下馬鈴薯淀粉—糖代謝的主要酶類與還原糖含量的動態(tài)變化關系，明確其主要的調(diào)控因子。在此基礎上，結合前人的研究結果，分離克隆淀粉—糖代謝關鍵酶的調(diào)控基因，并通過轉化馬鈴薯進行功能驗證，以進一步揭示馬鈴薯塊莖淀粉—糖代謝的分子機理，為改良馬鈴薯加工品質提供理論依據(jù)和技術基礎。研究取得的主要結果如下： 1.以不同貯藏溫度條件下的鄂馬鈴薯1號(E1)和鄂馬鈴薯3號(E3)品種為材料，對貯藏塊莖還原糖、

3、總糖含量及淀粉-糖代謝中酶活性變化規(guī)律進行研究，以明確馬鈴薯炸片色澤指數(shù)的主要影響因素。結果表明，貯藏期間低溫是促進塊莖還原糖累積的主要影響因素，還原糖含量與炸片色澤具有極顯著直線正相關關系。進一步分析表明，在4℃貯藏條件下，腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)和蔗糖合成酶活性(SuSy)與塊莖還原糖含量呈顯著負指數(shù)相關，酸性轉化酶(AcidInv)和堿性轉化酶(AlkalineInv)

4、活性與塊莖還原糖的積累呈顯著直線正相關，是淀粉—糖代謝過程中影響塊莖“低溫糖化”的主要因子。 2.轉化酶抑制子是一類同源性較低的蛋白質家族，通過轉化酶抑制子的調(diào)控可能達到抑制轉化酶活性，進而調(diào)控還原糖積累的效果。本研究根據(jù)已報道的煙草轉化酶抑制子序列設計特異引物，通過RT-PCR法在煙草T1系中成功分離到液泡轉化酶抑制子基因Nt-inhh全長cDNA。序列分析表明，該基因編碼區(qū)與報道的Nt-inhh基因完全一致。通過構建35S和

5、塊莖特異的patatin啟動子調(diào)控下含有Nt-inhh基因cDNA的表達載體轉化馬鈴薯。分析轉基因植株塊莖在4℃和20℃貯藏一個月后還原糖含量與液泡酸性轉化酶活性表明，Ⅵ活性下降幅度為22.7％(株系A-3)至78.7％(株系B-13)，還原糖下降幅度為20％(株系A-17)至80.5(株系A-30)，說明Nt-inhhcDNA在馬鈴薯中的表達成功抑制了液泡酸性轉化酶的活性，導致還原糖含量降低。實驗還進一步證實了低溫貯藏塊莖液泡酸性轉化

6、酶活性與還原糖含量呈正相關關系。 3.轉化酶抑制子是高等植物普遍存在的一類蛋白質家族，本研究用RT-PCR結合5，RACE方法從馬鈴薯栽培種JH塊莖中克隆了轉化酶抑制子St-inhcDNA。序列分析表明，St-inh基因編碼區(qū)全長663bp，編碼221個氨基酸。將St-inh基因克隆到pET28a(+)上，轉化大腸桿菌BL21(DE3)后成功實現(xiàn)了表達?；虮磉_產(chǎn)物與馬鈴薯栽培品種(系)E1、JH試管塊莖以及番茄果實的轉化酶提取

7、物共孵育結果顯示，其轉化酶活性分別下降了34.3％、21％和33.8％。表達產(chǎn)物與E3葉片Ⅵ和CWI提取物反應顯示，隨著表達產(chǎn)物量的增加，抑制作用加強，說明St-inh的翻譯產(chǎn)物具有轉化酶抑制子功能。T-COFFEE氨基酸序列對比分析顯示，St-inh與Kunitz-typeC類基因序列同源性達95％以上，該基因編碼的蛋白質具有典型的Kunitz-type結構域[L，I，V，M]-X-D-X-[E，D，N，T，Y]-[D，G]-[R，K

8、，H，D，E，N，Q]-X-[L，I，V，M]-X(5)-Y-X-[L，I，V，M]，因此St-inh基因可能為Kunitz-type家族成員。氨基酸序列Clustalw分析表明，St-inh與Ara-inh、Nt-inhh、Nt-inh、To-inh、Pa-inh、Ip-inh、Ci-inh以及Zm-inh的同源性為14.2～21.0％，說明轉化酶抑制子是一類同源性較低的蛋白質家族，所克隆的St-inh是一個新的來自馬鈴薯的轉化酶抑制

9、子基因。 4.從鄂馬鈴薯3號試管塊莖DNA中分離了低溫誘導的啟動子LTP，構建35S和LTP驅動的正義St-inh基因的表達載體分別轉化鄂馬鈴薯3號，PCR、Northern雜交檢測表明已經(jīng)成功獲得表達St-inhcDNA的轉基因植株。轉基因植株塊莖4℃和20℃貯藏一個月后，塊莖還原糖含量降幅最大的達80.3％(E-1)，Ⅵ下降幅度最大的達54.2％(D-7)。4℃時，與對照比較，所檢測轉基因植株平均還原糖含量下降21.0％，Ⅵ

10、活性下降19.0％，Ⅵ活性與還原糖含量存在明顯的相關關系，進一步說明轉化酶是塊莖“低溫糖化”的主要因素之一，通過調(diào)控轉化酶抑制子的表達可有效調(diào)控轉化酶活性和還原糖積累。進一步的Northern雜交分析表明，與非轉基因株系比較，由于正義St-inh基因的轉入，St-inh表達量明顯增加，且低溫誘導啟動子控制下的St-inh在低溫貯藏塊莖中的表達顯著提高，但所使用的啟動子對塊莖還原糖積累的抑制作用影響不大，說明組成型或誘導型的St-inh基