低溫誘導的馬鈴薯塊莖特異融合啟動子的構建及低溫調控因子St-CBF的鑒定.pdf

1、馬鈴薯是世界第四大糧食作物，其塊莖除用作鮮食外，還作為工業(yè)原料加工各種食品和其它淀粉產品，其中薯片和薯條等加工產品的生產在馬鈴薯加工業(yè)中占據重要位置。為了延長加工周期，低溫貯藏是最經濟有效的方法，然而低溫導致還原糖的大量累積，使得在高溫油炸時還原糖與自由氨基酸發(fā)生褐化反應，嚴重影響了加工產品的品質。馬鈴薯油炸加工品質改良的基因工程目前已作為重要的育種途徑在國內外展開研究，為使目的基因在不干擾馬鈴薯正常生長而只在貯藏期間低溫誘導表達，低溫

2、誘導的塊莖特異表達啟動子成為油炸加工品質基因工程育種的迫切需要。本研究在克隆相關低溫誘導表達基因啟動子的基礎上，構建具有低溫誘導活性的塊莖特異表達融合啟動子，評價其在馬鈴薯基因工程中潛在的應用價值。并在此基礎上，對馬鈴薯中調控低溫誘導啟動子活性的蛋白質因子進行了初步研究，取得的主要研究結果如下：
　　 1.低溫啟動子誘導活性分析：采用PCR方法分別從擬南芥和馬鈴薯中克隆了低溫誘導cor15a基因的啟動子和ci21A基因的啟動子。

3、序列比較分析顯示，cor15a基因的啟動子含有目前研究確定的低溫響應元件“LTRE”，而ci21A基因的啟動子中沒有該元件。將cor15a基因啟動子和ci21A基因啟動子分別與GUS基因連接，構建了表達載體pLB和pCI21A，采用根癌農桿菌介導的轉化技術轉化煙草并獲得轉基因植株。轉基因煙草的GUS染色和GUS活性熒光定量分析結果顯示，cor15a基因啟動子和ci21A基因啟動子在煙草中都具有表達功能，總體表達強度分析顯示，ci21A基

4、因啟動子表達強度高于cor15a基因啟動子，但cor15a基因啟動子對低溫誘導的敏感性強于ci21A基因啟動子。
　　 2.cor15a基因啟動子在馬鈴薯中表達活性鑒定：為了檢測cor15a基因啟動子在馬鈴薯中是否具有低溫誘導活性，本研究將表達載體pLB通過農桿菌介導轉化馬鈴薯“鄂馬鈴薯3號(E3)”并獲得轉化再生植株。轉基因馬鈴薯的GUS染色和GUS活性熒光定量分析結果證明，cor15a基因啟動子在馬鈴薯中仍具有低溫銹導表達特

5、性。在沒有低溫處理的對照組中，各被測樣品組織中均檢測不到GUS的酶活性，低溫處理后，在莖，葉，塊莖和匍匐莖組織中均可以檢測到不同強度的GUS活性，其中葉片和塊莖中的活性相對較高。
　　 3.cor15a基因啟動子和塊莖特異啟動子(CIPP)的特異核心啟動子區(qū)域表達活性鑒定：實驗將cor15a基因啟動子的-297/+70(含有一個低溫響應元件LTRE)與GUS基因連接，構建了轉化載體pL297-121，將CIPP啟動子的-340/

6、+19(含有塊莖特異表達調控序列TSSR)與GUS基因連接，構建了轉化載體pC340-121。pL297-121和pC340-121分別轉化馬鈴薯E3獲得轉基因植株，分析顯示，載體pL297-121在除根以外所有被檢測的組織中均具有低溫誘導表達功能，但表達強度低于完整cor15a基因啟動子。pC340-121在塊莖中的表達活性明顯高于莖，根和匍匐莖，而在葉片中則始終未檢測到它的活性。同時低溫處理后，pC340-121的活性在所有被測組織

7、中均沒有變化，表明該TSSR序列的調控活性不受低溫環(huán)境的影響。
　　 4.低溫誘導的馬鈴薯塊莖特異啟動子構建與表達功能鑒定：以低溫誘導cor15a基因的啟動子和馬鈴薯塊莖特異啟動子CIPP為基礎，采用重疊延伸PCR的方法，將cor15a基因啟動子中含有低溫響應元件LTRE的-297/-42和-297/+70片段分別與CIPP啟動子中含有塊莖特異表達序列TSSR的-340/+19和-340/-28片段進行融合，按照核心序列相對于T

8、ATA-box位置的不同，構建了2個融合啟動子pCL(TSSR靠近TATA-box)和pLC(LTRE靠近TATA-box)，并將2個融合啟動子分別與GUS基因連接，通過農桿菌介導的基因轉化，將融合啟動子pCL和pLC導入E3獲得轉基因植株。分析結果顯示，融合啟動子pCL和pLC均具有表達功能，但核心功能序列相對于TATA-box的位置不同其表達強度具有顯著差異。塊莖特異表達序列TSSR靠近TATA-box的pCL，GUS表達強度顯著高

9、于低溫誘導核心啟動子序列LTRE靠近TATA-box的pLC，特別是在塊莖和匍匐莖中表現(xiàn)更為突出。
　　 5.馬鈴薯St-CBF轉錄因子的鑒定：本研究根據已報道的EST序列設計引物，采用基于PCR的技術從馬鈴薯兩個基因型(E3和CW2-1)中克隆到St-CBF基因的蛋白質編碼區(qū)序列。序列分析顯示該片段長600bp，編碼199個氨基酸，具有CBF/DREB轉錄因子的保守結構域ERF/AP2，同時還具一個富含絲氨酸/蘇氨酸的保守區(qū)域

10、，一個核定位信號NLS(PKRPAGRKKFRETRHP)和一個保守的DSAW-Motif。該St-CBF具備CBF1/DREB1類轉錄因子的典型特征。氨基酸序列比對分析表明，St-CBF與許多植物中的CBF/DREB轉錄因子蛋白具有較高的同源性。將St-CBF基因克隆到pGEX-6P-1上與谷胱苷肽-S-轉移酶進行融合，并在大腸桿菌中BL21(DE3)中成功進行了融合蛋白的表達。凝膠阻滯實驗表明，該融合蛋白能夠與cor15a基因啟動子