低溫誘導(dǎo)的馬鈴薯塊莖特異融合啟動(dòng)子的構(gòu)建及低溫調(diào)控因子St-CBF的鑒定.pdf

1、馬鈴薯是世界第四大糧食作物，其塊莖除用作鮮食外，還作為工業(yè)原料加工各種食品和其它淀粉產(chǎn)品，其中薯片和薯?xiàng)l等加工產(chǎn)品的生產(chǎn)在馬鈴薯加工業(yè)中占據(jù)重要位置。為了延長(zhǎng)加工周期，低溫貯藏是最經(jīng)濟(jì)有效的方法，然而低溫導(dǎo)致還原糖的大量累積，使得在高溫油炸時(shí)還原糖與自由氨基酸發(fā)生褐化反應(yīng)，嚴(yán)重影響了加工產(chǎn)品的品質(zhì)。馬鈴薯油炸加工品質(zhì)改良的基因工程目前已作為重要的育種途徑在國(guó)內(nèi)外展開(kāi)研究，為使目的基因在不干擾馬鈴薯正常生長(zhǎng)而只在貯藏期間低溫誘導(dǎo)表達(dá)，低溫

2、誘導(dǎo)的塊莖特異表達(dá)啟動(dòng)子成為油炸加工品質(zhì)基因工程育種的迫切需要。本研究在克隆相關(guān)低溫誘導(dǎo)表達(dá)基因啟動(dòng)子的基礎(chǔ)上，構(gòu)建具有低溫誘導(dǎo)活性的塊莖特異表達(dá)融合啟動(dòng)子，評(píng)價(jià)其在馬鈴薯基因工程中潛在的應(yīng)用價(jià)值。并在此基礎(chǔ)上，對(duì)馬鈴薯中調(diào)控低溫誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性的蛋白質(zhì)因子進(jìn)行了初步研究，取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1.低溫啟動(dòng)子誘導(dǎo)活性分析：采用PCR方法分別從擬南芥和馬鈴薯中克隆了低溫誘導(dǎo)cor15a基因的啟動(dòng)子和ci21A基因的啟動(dòng)子。

3、序列比較分析顯示，cor15a基因的啟動(dòng)子含有目前研究確定的低溫響應(yīng)元件“LTRE”，而ci21A基因的啟動(dòng)子中沒(méi)有該元件。將cor15a基因啟動(dòng)子和ci21A基因啟動(dòng)子分別與GUS基因連接，構(gòu)建了表達(dá)載體pLB和pCI21A，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化煙草并獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色和GUS活性熒光定量分析結(jié)果顯示，cor15a基因啟動(dòng)子和ci21A基因啟動(dòng)子在煙草中都具有表達(dá)功能，總體表達(dá)強(qiáng)度分析顯示，ci21A基

4、因啟動(dòng)子表達(dá)強(qiáng)度高于cor15a基因啟動(dòng)子，但cor15a基因啟動(dòng)子對(duì)低溫誘導(dǎo)的敏感性強(qiáng)于ci21A基因啟動(dòng)子。
　　 2.cor15a基因啟動(dòng)子在馬鈴薯中表達(dá)活性鑒定：為了檢測(cè)cor15a基因啟動(dòng)子在馬鈴薯中是否具有低溫誘導(dǎo)活性，本研究將表達(dá)載體pLB通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化馬鈴薯“鄂馬鈴薯3號(hào)(E3)”并獲得轉(zhuǎn)化再生植株。轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的GUS染色和GUS活性熒光定量分析結(jié)果證明，cor15a基因啟動(dòng)子在馬鈴薯中仍具有低溫銹導(dǎo)表達(dá)特

5、性。在沒(méi)有低溫處理的對(duì)照組中，各被測(cè)樣品組織中均檢測(cè)不到GUS的酶活性，低溫處理后，在莖，葉，塊莖和匍匐莖組織中均可以檢測(cè)到不同強(qiáng)度的GUS活性，其中葉片和塊莖中的活性相對(duì)較高。
　　 3.cor15a基因啟動(dòng)子和塊莖特異啟動(dòng)子(CIPP)的特異核心啟動(dòng)子區(qū)域表達(dá)活性鑒定：實(shí)驗(yàn)將cor15a基因啟動(dòng)子的-297/+70(含有一個(gè)低溫響應(yīng)元件LTRE)與GUS基因連接，構(gòu)建了轉(zhuǎn)化載體pL297-121，將CIPP啟動(dòng)子的-340/

6、+19(含有塊莖特異表達(dá)調(diào)控序列TSSR)與GUS基因連接，構(gòu)建了轉(zhuǎn)化載體pC340-121。pL297-121和pC340-121分別轉(zhuǎn)化馬鈴薯E3獲得轉(zhuǎn)基因植株，分析顯示，載體pL297-121在除根以外所有被檢測(cè)的組織中均具有低溫誘導(dǎo)表達(dá)功能，但表達(dá)強(qiáng)度低于完整cor15a基因啟動(dòng)子。pC340-121在塊莖中的表達(dá)活性明顯高于莖，根和匍匐莖，而在葉片中則始終未檢測(cè)到它的活性。同時(shí)低溫處理后，pC340-121的活性在所有被測(cè)組織

7、中均沒(méi)有變化，表明該TSSR序列的調(diào)控活性不受低溫環(huán)境的影響。
　　 4.低溫誘導(dǎo)的馬鈴薯塊莖特異啟動(dòng)子構(gòu)建與表達(dá)功能鑒定：以低溫誘導(dǎo)cor15a基因的啟動(dòng)子和馬鈴薯塊莖特異啟動(dòng)子CIPP為基礎(chǔ)，采用重疊延伸PCR的方法，將cor15a基因啟動(dòng)子中含有低溫響應(yīng)元件LTRE的-297/-42和-297/+70片段分別與CIPP啟動(dòng)子中含有塊莖特異表達(dá)序列TSSR的-340/+19和-340/-28片段進(jìn)行融合，按照核心序列相對(duì)于T

8、ATA-box位置的不同，構(gòu)建了2個(gè)融合啟動(dòng)子pCL(TSSR靠近TATA-box)和pLC(LTRE靠近TATA-box)，并將2個(gè)融合啟動(dòng)子分別與GUS基因連接，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化，將融合啟動(dòng)子pCL和pLC導(dǎo)入E3獲得轉(zhuǎn)基因植株。分析結(jié)果顯示，融合啟動(dòng)子pCL和pLC均具有表達(dá)功能，但核心功能序列相對(duì)于TATA-box的位置不同其表達(dá)強(qiáng)度具有顯著差異。塊莖特異表達(dá)序列TSSR靠近TATA-box的pCL，GUS表達(dá)強(qiáng)度顯著高

9、于低溫誘導(dǎo)核心啟動(dòng)子序列LTRE靠近TATA-box的pLC，特別是在塊莖和匍匐莖中表現(xiàn)更為突出。
　　 5.馬鈴薯St-CBF轉(zhuǎn)錄因子的鑒定：本研究根據(jù)已報(bào)道的EST序列設(shè)計(jì)引物，采用基于PCR的技術(shù)從馬鈴薯兩個(gè)基因型(E3和CW2-1)中克隆到St-CBF基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)序列。序列分析顯示該片段長(zhǎng)600bp，編碼199個(gè)氨基酸，具有CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域ERF/AP2，同時(shí)還具一個(gè)富含絲氨酸/蘇氨酸的保守區(qū)域

10、，一個(gè)核定位信號(hào)NLS(PKRPAGRKKFRETRHP)和一個(gè)保守的DSAW-Motif。該St-CBF具備CBF1/DREB1類轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。氨基酸序列比對(duì)分析表明，St-CBF與許多植物中的CBF/DREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白具有較高的同源性。將St-CBF基因克隆到pGEX-6P-1上與谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行融合，并在大腸桿菌中BL21(DE3)中成功進(jìn)行了融合蛋白的表達(dá)。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明，該融合蛋白能夠與cor15a基因啟動(dòng)子