馬鈴薯野生種Solanum berthaultii抗低溫糖化基因的分離及表達特征分析.pdf

1、為實現(xiàn)馬鈴薯全年供應，同時減少采后病蟲害、塊莖萌發(fā)和失水等帶來的損失，用于加工的馬鈴薯通常需要儲藏在4℃左右的低溫環(huán)境中，但這樣又帶來另一個嚴重的負面影響-低溫糖化(Cold-induced sweetening，CIS)，即塊莖低溫儲藏過程中，易發(fā)生糖化，出現(xiàn)淀粉含量下降、還原糖積累的現(xiàn)象。發(fā)生糖化的塊莖在油炸加工過程中，還原糖和游離氨基酸發(fā)生Maillard反應，以致出現(xiàn)褐色變化、口感變差，并產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性的致癌物質(zhì)丙烯酰胺，嚴重

2、降低了加工產(chǎn)品的品質(zhì)，給馬鈴薯種植業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。馬鈴薯品種改良是控制這一危害的重要途徑。
　　 不同馬鈴薯基因型發(fā)生低溫糖化的程度具有差異，特別是一些野生種，具有較強的抗低溫糖化的能力。因此，了解馬鈴薯低溫糖化的調(diào)節(jié)機制和發(fā)掘低溫糖化的關(guān)鍵基因，對馬鈴薯加工品質(zhì)的改良具有重要意義。
　　 本研究選用抗低溫糖化的野生種Solanum berthaultii(accession CW2-1，ber)和不抗低溫糖化的栽培

3、品種(S.tuberosum)鄂馬鈴薯3號(E3)為材料，篩選塊莖低溫應答基因，進而通過在不同抗性材料中的基因表達譜分析，獲得與低溫糖化相關(guān)的基因。研究取得的主要結(jié)果如下：
　　 1.不同抗低溫糖化馬鈴薯的炸片色澤指數(shù)和可溶性糖含量對低溫的響應
　　 為評價儲藏溫度對不同塊莖炸片色澤、還原糖以及蔗糖含量的影響，本研究分別分析了馬鈴薯ber和E3塊莖在4℃和20℃儲藏0、3、5、10、15、20、30、45、60、75和9

4、0d時相關(guān)指標的變化情況。結(jié)果表明，在20℃儲藏時塊莖炸片色澤和糖含量變化較小?？傮w來說，低溫儲藏時，塊莖還原糖和蔗糖含量隨著儲藏時間延長而不斷增加，盡管在儲藏后期有小幅下降，但ber塊莖的還原糖含量明顯低于E3塊莖，蔗糖含量則高于E3塊莖，而且還原糖含量和炸片色澤之間呈顯著線性正相關(guān)。表明野生種ber相對于栽培種E3而言具有較高的抗低溫糖化能力。
　　 2.反向差減雜交文庫的構(gòu)建
　　 為進一步分析ber低溫反應及抗低

5、溫糖化的機理，本研究在楊建文(2005)構(gòu)建的ber正向低溫差減雜交文庫的基礎(chǔ)上，分別以4℃和20℃儲藏5d的ber塊莖為Driver和Tester，構(gòu)建反向差減雜交文庫。在經(jīng)過兩輪差減雜交和選擇性PCR擴增之后，將獲得的差減雜交產(chǎn)物連入pBlueScript SK(-)，通過Amp/X-gal/IPTG篩選獲得1920個白色單斑，經(jīng)過進一步PCR擴增篩選，最終獲得由1584個有效克隆構(gòu)成的反向SSH文庫，克隆中的插入片段長度約為500

6、bp。
　　 3.ber塊莖低溫反應基因的確定
　　 通過PCR擴增獲得ber正向文庫中2112條插入序列和反向文庫中1584條插入序列，純化后定量，作為點制芯片的探針。提取ber塊莖4℃和20℃儲藏5d后的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄時分別用Cy5和Cy3進行標記，并與cDNA芯片進行雜交，共獲得736個差異表達基因，其中663個上調(diào)，73個下調(diào)。差異表達基因序列分析時共有719個克隆獲得良好測序結(jié)果。經(jīng)序列比對、合并重復后，共獲

7、得188個代表不同基因的非重復序列片段，其中上調(diào)表達序列138個，下調(diào)表達序列50個。經(jīng)分析，149個已知功能的差異表達基因可被歸為14種功能類型，主要與細胞自救與防御、代謝、能量、蛋白命運等細胞過程相關(guān)。本研究首次對馬鈴薯低溫響應的差異表達基因進行了系統(tǒng)分析，為進一步研究低溫糖化機制奠定了基礎(chǔ)。
　　 4.塊莖低溫糖化相關(guān)基因的篩選
　　 以抗低溫糖化的ber塊莖和易低溫糖化的E3塊莖為材料，通過qRT-PCR方法全面

8、分析上述188個差異表達基因在4℃和20℃儲藏時動態(tài)表達變化。結(jié)果表明，這些基因中的絕大部分在兩種塊莖中表現(xiàn)出相同的調(diào)節(jié)模式，反映了不同基因型塊莖低溫應答機制具有同一性；但是仍有一些基因的表達模式或轉(zhuǎn)錄水平在兩種基因型塊莖中存在較大差異，初步推測這些“特異表達基因”的表達強弱，決定了不同基因型塊莖間低溫糖化水平的差異。例如，低溫儲藏時，ber C20-3-014(GWD)和C20-6-K02(木糖異構(gòu)酶)基因的轉(zhuǎn)錄被抑制，而E3塊莖則為

9、上調(diào)表達，并且表達量均高于ber塊莖；ber和E3塊莖C20-2-D03(BMY7)和C20-4-C15(InvInh)基因具有明顯的低溫誘導特性，但ber BMY7轉(zhuǎn)錄水平低于E3，而ber InvInh則高于E3；另外，低溫下ber和E3塊莖C20-6-F06(GAPDH)和C20-3-A14(丙酮酸激酶)基因都呈先上調(diào)后下調(diào)的表達模式，但這兩個基因在ber塊莖中的累積量始終高于E3塊莖。因此，與E3塊莖相比，ber低溫儲藏時很可能