實(shí)驗(yàn)大小鼠螺桿菌流行病學(xué)調(diào)查及肝螺桿菌flaB基因的表達(dá).pdf

1、嚙齒動(dòng)物螺桿菌(Rodent Helicobacter)屬于螺桿菌菌屬(Helicobacter)，是一群革蘭氏染色陰性，微需氧條件生長(zhǎng)且營(yíng)養(yǎng)要求較高的螺旋狀細(xì)菌。主要以隱性感染形式普遍存在于大鼠、小鼠、沙鼠等嚙齒動(dòng)物的消化道。不同株型的細(xì)菌在不同品系、年齡和免疫狀態(tài)的嚙齒動(dòng)物中可引起宿主不同程度的病理反應(yīng)從而導(dǎo)致盲腸結(jié)腸炎、肝炎、膽囊炎等各種組織炎癥甚至惡性腫瘤的發(fā)生，其中肝螺桿菌(Helicobacter hepaticus，H.h

2、epaticus)是目前研究較多的嚙齒動(dòng)物螺桿菌，也是已明確具有致癌原的螺桿菌。動(dòng)物感染螺桿菌后會(huì)改變各種免疫應(yīng)答參數(shù)，干擾試驗(yàn)結(jié)果。國(guó)外已有大量報(bào)道大小鼠種群螺桿菌有很高的感染比例，因此，建立快速診斷方法十分必要。
　　 世界各國(guó)及國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物理事會(huì)已將該類螺桿菌列為嚙齒實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須排除的病原微生物，而我國(guó)由于缺乏模式菌株和有效的檢測(cè)方法，至今尚未將其列入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。本研究從小鼠中分離培養(yǎng)了嚙齒動(dòng)物螺桿菌；調(diào)查了上海

3、及周邊地區(qū)實(shí)驗(yàn)大小鼠螺桿菌攜帶情況，為我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物螺桿菌等級(jí)及監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考和依據(jù)；通過原核表達(dá)系統(tǒng)制備肝螺桿菌鞭毛蛋白重組抗原，以期作為建立ELISA診斷方法的候選抗原。
　　 1.肝螺桿菌的分離、培養(yǎng)及初步鑒定：從經(jīng)免疫抑制的SPF級(jí)C57BL/6小鼠回盲部取材接種哥倫比亞選擇性血平皿，將微需氧產(chǎn)氣袋置厭氧罐中制造出微需氧環(huán)境，37℃培養(yǎng)3～7d，經(jīng)過形態(tài)、生化及PCR擴(kuò)增16SrRNA基因測(cè)序鑒定，呈現(xiàn)肝螺桿菌的典

4、型生物學(xué)特性，與GenBank庫(kù)中H.hepaticus16SrRNA(emb|AJ007931.1)基因序列進(jìn)行比對(duì)，同源性達(dá)到98％，成功分離到一株H.hepaticus。
　　 2.上海及周邊地區(qū)實(shí)驗(yàn)大小鼠螺桿菌攜帶情況調(diào)查：用PCR法測(cè)得實(shí)驗(yàn)大鼠陽(yáng)性率為70.3％(71/101)，其中清潔級(jí)、SPF級(jí)分別為69.6％(48/69)和71.9％(23/32)；實(shí)驗(yàn)小鼠陽(yáng)性率為35.8％(126/352)，其中清潔級(jí)、SPF

5、級(jí)陽(yáng)性率分別為51.5％(52/101)和29.5％(74/251)；ELISA法測(cè)得實(shí)驗(yàn)大鼠陽(yáng)性率為52.7％(87/165)，其中清潔級(jí)、SPF級(jí)分別為53.6％(45/84)和51.9％(42/81)；實(shí)驗(yàn)小鼠陽(yáng)性率為15.9％(14/88)，其中清潔級(jí)、SPF級(jí)分別為19.2％(5/26)和14.5％(9/62)。用五種嚙齒動(dòng)物螺桿菌特異性16SrRNA基因引物進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示在攜帶螺桿菌的107只小鼠及68只大鼠中，主要攜

6、帶的是H.rodentium、H.hepaticus和H.bilis三種。上述數(shù)據(jù)表明上海及周邊地區(qū)實(shí)驗(yàn)大小鼠中皆存在不同程度的螺桿菌感染。
　　 3.肝螺桿菌flaB基因的表達(dá)、純化和抗體制備：根據(jù)GenBank公布的Hh ATCC51449 flaB基因序列(NC004917.1)，人工合成flaB全基因序列，PCR擴(kuò)增后將目的片段插入pGEM-T載體，并測(cè)序鑒定。目的條帶亞克隆于原核表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒p

7、ET-flaB，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western blot鑒定表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果顯示融合蛋白約54KDa，以可溶性形式存在。經(jīng)Ni-NTA Agarose柱純化后的重組蛋白免疫BALB/c小鼠，制備抗重組flaB蛋白血清，采用Hh全菌抗體的Western blot和鼠抗重組flaB蛋白血清的間接ELISA試驗(yàn)鑒定重組蛋白的免疫反應(yīng)性和抗原性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成功構(gòu)建HhpET-flaB高