貝氏隱孢子蟲Rhomboid基因的生物信息學分析及其核酸疫苗的免疫保護效果研究.pdf

1、隱孢子蟲（Cryptosporidium）是一種重要的頂復門原蟲，主要寄生于宿主的呼吸道和消化道上皮細胞，引起隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)。該病在人、動物和自然界中廣泛存在，對免疫功能低下的個體危害尤為嚴重，常導致持續(xù)性腹瀉或營養(yǎng)不良，甚至危及生命。目前，對于隱孢子蟲病尚無有效防治措施，探索候選靶抗原的結(jié)構(gòu)和功能特性，從而制備特異性抗體和疫苗成為了該領域研究的新方向。
　　本研究將GenBank中發(fā)表的C.pa

2、rvum、C.hominis和C.muris的菱形體蛋白基因序列進行比對分析，設計合成該基因保守片段的1對特異性引物，以貝氏隱孢子蟲基因組DNA作為模板，通過PCR擴增出CbROM基因保守片段，采用染色體步移技術獲得基因片段3'端和5'端未知核苷酸序列，對所得序列進行測序并拼接。對所獲得序列的生物信息學分析表明，該基因的開放閱讀框大小為1422bp，編碼473個氨基酸，與C.parvum、C.hominis和C.muris的相應基因進行

3、比對分析發(fā)現(xiàn)，核苷酸同源性分別為68.2％、66.7％、59.6％，氨基酸序列同源性分別為61.8％、68.6％、51.6％。基因所編碼蛋白質(zhì)的理論分子量為52.7 kDa，等電點為8.65，是疏水性蛋白質(zhì)，含有7個串連的跨膜螺旋區(qū)，無信號肽;該基因含有典型的菱形體蛋白相關保守結(jié)構(gòu)域，屬于菱形體蛋白酶家族;功能位點分析結(jié)果顯示，CbROM蛋白序列包含6個N-糖基化位點，2個cAMP、cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點，8個蛋白激酶C磷酸化

4、位點，7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點和10個N-豆蔻?；稽c;二級結(jié)構(gòu)中包含α-螺旋38.27％，β-折疊16.70％和無規(guī)則卷曲45.03％。
　　以C.baileyi總RNA為模板，結(jié)合RT-PCR和巢氏PCR方法，擴增CbROM基因，克隆至pMD18-T Simple載體，測序鑒定序列正確后，經(jīng)SacⅠ和KpnⅠ雙酶切，亞克隆至pEGFP-C2真核表達載體，構(gòu)建pEGFP-CbROM真核表達質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體介導法，將陽性重組質(zhì)粒

5、瞬時轉(zhuǎn)染入CEF細胞;通過共聚焦顯微鏡觀察和Western-Blot檢測，分析CbROM基因在體外表達情況。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-CbROM轉(zhuǎn)染CEF細胞48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到較強的綠色熒光信號，Western-Blot試驗也成功檢測到了重組質(zhì)粒在體外的表達產(chǎn)物，在大小約為80 kDa處出現(xiàn)EGFP-CbROM融合蛋白特異性條帶，
　　用已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pEGFP-CbROM免疫雛雞，觀察其對動物機體誘導產(chǎn)生

6、的免疫應答反應，然后經(jīng)口接種貝氏隱孢子蟲卵囊進行人工感染，評價該核酸疫苗對貝氏隱孢子蟲感染的免疫保護效果。結(jié)果表明，pEGFP-CbROM核酸疫苗可以使疫苗免疫組動物血清中抗體水平和外周血液T淋巴細胞增殖能力與對照組相比顯著提高(P＜0.05)，而外周血液B淋巴細胞增殖能力僅在高劑量(100μg)重組質(zhì)粒免疫組與不免疫不感染組之間存在顯著差異(P＜0.05)。攻蟲后，中劑量(50μg)和高劑量（100μg）重組質(zhì)粒免疫組雛雞較其他組相比

7、排卵持續(xù)時間分別縮短2d和4d，疫苗免疫組之間的增重情況無顯著差異(P＞0.05)，但與非核酸疫苗免疫組之間差異顯著(P＜0.05)。
　　綜上所述，本研究首次獲得了CbROM基因全序列，并對其基因特征、理化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)等進行預測，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pEGFP-CbROM，并在體外檢測到了融合蛋白的正確表達，使用該重組質(zhì)粒作為核酸疫苗免疫雛雞，在高劑量（100μg）重組質(zhì)粒免疫組觀察到試驗動物對貝氏隱孢子蟲感染產(chǎn)生了一定免疫保護