剛地弓形蟲磷酸甘油變位酶2基因的生物信息學(xué)分析、克隆表達(dá)及免疫保護(hù)性研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　 對剛地弓形蟲磷酸甘油酸變位酶2（TgPGAM2）基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對該基因進(jìn)行克隆、表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物純化后分析其免疫原性；觀察重組弓形蟲磷酸甘油酸變位酶2蛋白（rTgPGAM2)免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答及其抗弓形蟲感染的能力，探討TgPGAM2作為弓形蟲疫苗候選抗原的可能性。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 第一部分：綜述脊椎動(dòng)物、無脊椎動(dòng)物、原生動(dòng)物等不同來源PGAM蛋白的理化性質(zhì)及研究

2、進(jìn)展。
　　 第二部分：對TgPGAM2基因的主要特性及抗原表位進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用蛋白分析專家系統(tǒng)（ExPASy)提供的ProtParam、SOSUI、TMHMM、HNN、MotifScan，NCBI上的ORF finder、Bcepred等生物信息學(xué)在線分析程序，結(jié)合Gene Runner、DNAman等生物信息學(xué)軟件，分析、預(yù)測TgPGAM2蛋白的理化性質(zhì)、可溶性、表面可及性、可塑性，跨膜區(qū)，翻譯后修飾位點(diǎn)、親（疏）水

3、性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、抗原表位等。
　　 第三部分：構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a/TgPGAM2，并在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性蛋白。對原核表達(dá)的rTgPGAM2進(jìn)行純化及免疫原性分析。收集、純化RH株弓形蟲速殖子，提取總RNA;設(shè)計(jì)合成引物并引入KpnI和BamHI酶切位點(diǎn)，RT-PCR擴(kuò)增編碼TgPGAM2的基因片段克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a中，陽性克隆經(jīng)雙酶切、PCR及測序鑒定陽性克??；在大腸桿菌BL21(DE3)中用IPTG誘導(dǎo)表

4、達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。大量表達(dá)rTgPGAM2，以Ni-NTA層析法純化蛋白，用兔抗弓形蟲血清做Western blotting分析其免疫原性。
　　 第四部分：觀察不同劑量rTgPGAM2滴鼻免疫小鼠誘導(dǎo)的黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答及抗弓形蟲感染作用。BALB/c小鼠60只隨機(jī)分為5組，免疫組分別用10μg、20μg、30μg、40μgrTgPGAM2/只滴鼻免疫小鼠，免疫2次，間隔2周，rTgPGAM2溶于20μl

5、 PBS中，對照組用等量PBS滴鼻。末次免疫后第14d，隨機(jī)取每組5只小鼠，頸椎脫臼處死，檢測腸液slgA和血清IgG、IL-2、IL-4、IFN-γ，分離并計(jì)數(shù)腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞(intestinAlintraepitheliallymphocytes，IEL)及脾淋巴細(xì)胞。其余35只小鼠每只用1×104個(gè)速殖子灌胃，觀察小鼠健康情況。攻擊后第30d，頸椎脫臼處死小鼠，計(jì)數(shù)肝、腦組織內(nèi)弓形蟲速殖子。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　

6、 通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，剛地弓形蟲PGAM2有10個(gè)表面可及性參數(shù)≥1.9的區(qū)域、3個(gè)親水性參數(shù)得分≥1.9的區(qū)域、3個(gè)柔韌性參數(shù)得分≥2的區(qū)域、8個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)、16個(gè)潛在抗原表位，可能具有免疫原性。
　　 以RH株弓形蟲速殖子的cDNA為摸板，擴(kuò)增獲得756bp的TgPGAM2基因片段，并成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a/TgPGAM2; IPTG誘導(dǎo)后行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明目的基因在大腸桿菌BL21(DE3)中

7、高效表達(dá)，相對分子量(Mr)約30ku。Western blotting顯示，純化后的rTgPGAM2能被兔抗弓形蟲免疫血清識(shí)別。
　　 30μg組血清IgG(A495=0.9704)、IFN-γ（A405=0.8456），腸液IgA（A495=0.9098）高于20μg組（血清IgG、IFN-γ，腸液IgA A495分別為0.8213、0.7244、0.6504），組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.741，F(xiàn)=4.53，F(xiàn)=6.9

8、4，P<0.05）。血清IL-2和IL-4組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。攻蟲后第7～14d，各組小鼠均出現(xiàn)倦怠、活動(dòng)減少、飲水及采食減少等表現(xiàn)，對照組小鼠死亡2只；40μg組1只。30μg組肝(58.3×105/g)、腦(3.99×105/g)組織內(nèi)速殖子蟲荷顯著低于對照組（肝93.88×105/g、腦5.65×105/g）和10μg組（肝85.54×105/g、腦4.86×105/g），組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.56，F(xiàn)=9.31，F(xiàn)=7

9、.39，F(xiàn)=9.68，P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，剛地弓形蟲PGAM2存在16個(gè)潛在的抗原表位，可能具有免疫原性。成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a/TgPGAM2并在大腸桿菌中高效表達(dá)可溶性蛋白。原核系統(tǒng)表達(dá)的rTgPGAM2具有免疫原性。30μg組rTgPGAM2滴鼻免疫更有效誘導(dǎo)了黏膜和系統(tǒng)免疫應(yīng)答，并有效降低弓形蟲感染鼠肝、腦組織中的蟲荷。本研究的結(jié)果表明，剛地弓形蟲PGAM2具有免疫