尼羅羅非魚性別特異性AFLP標(biāo)記的篩選及兩個基因的多態(tài)性與生長性狀的相關(guān)性分析.pdf

1、羅非魚是國際糧農(nóng)組織向全世界推薦的三大養(yǎng)殖魚類之一，目前已在全世界范圍內(nèi)推廣開來，其中尼羅羅非魚是養(yǎng)殖最為廣泛的一個品種。尼羅羅非魚雄魚的生長速度比雌魚大約快40%，因此通過性別控制技術(shù)生產(chǎn)全雄魚將顯著性提高群體產(chǎn)量，降低餌料系數(shù)。全雄羅非魚培育技術(shù)和性別特異性分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合將明顯提高全雄羅非魚的育種效率。本研究中利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對尼羅羅非魚的XX基因型雌魚、XY基因型雄魚和YY基因型超雄魚的基因組DNA進行篩選，最終獲得8

2、條與尼羅羅非魚X染色體相關(guān)的AFLP條帶，并將其中的一個條帶轉(zhuǎn)化為X染色體的SCAR標(biāo)記。
　　 在本實驗中，采用PstⅠ和MseⅠ的酶切組合對XX、XY和YY基因型尼羅羅非魚基因組DNA雙酶切，再進行酶切接頭的連接、預(yù)擴增和選擇性擴增。通過對256對選擇性擴增引物的篩選，在其中8對引物(P2M2、P2M11、P5M14、P6M5、P11M5、P14M16、P15M8和P15M13)的擴增結(jié)果中發(fā)現(xiàn)X染色體特異性條帶，并根據(jù)選擇

3、性擴增引物對這8個條帶進行命名。隨后對這8個條帶進行克隆、測序，并根據(jù)其測序結(jié)果進行基因組步移，成功獲得4個條帶(P2M2、P11M5、P15M8和P15M13)的側(cè)翼序列。為了驗證這4個片段及其側(cè)翼序列在X和Y染色體上的序列差異，分別在XX和YY基因型的尼羅羅非魚中擴增這4個片段及其側(cè)翼的部分序列。通過測序結(jié)果的比對，僅在P15M8的特異性片段中發(fā)現(xiàn)一個X和Y染色體之間的多態(tài)位點(C/T)。X染色體特異性片段P15M8及其側(cè)翼序列在N

4、CBI中進行Blast分析沒有發(fā)現(xiàn)其同源序列，我們認為這可能是某個未知基因的片段。根據(jù)這個多態(tài)位點設(shè)計一對SCAR引物NTX，分別在32個XX、XY和YY基因型的尼羅羅非魚中進行驗證，結(jié)果顯示XX和XY基因型個體中都擴增得到一條109 bp的條帶，而YY基因型中僅有一個個體擴增到這一條帶。因此認為，引物NTX可以為尼羅羅非魚超雄魚PCR鑒定方法的建立提供一些的參考，加快全雄尼羅羅非魚的育種進程。
　　 垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(

5、Pituitary adenylate cyclase-activating peptide，PACAP)是胰高血糖素家族的一員，能夠促進生長激素、促性腺激素和催乳素的分泌，影響大腦發(fā)育和繁殖。本研究利用RT-PCR和RACE方法成功分離尼羅羅非魚的PACAP基因，該基因cDNA全長為1013 bp，最大開放閱讀框528 bp，編碼175個氨基酸。通過PCR-SSCP方法對尼羅羅非魚PACAP基因的CDS區(qū)域進行SNPs檢測，在引物P2

6、的SSCP圖譜中呈現(xiàn)出多態(tài)性，將不同的帶型分別命名為AA、AB和BB基因型。通過測序發(fā)現(xiàn)PACAP基因的第二外顯子部分存在一個SNP位點(G42A)，該位點沒有引起編碼氨基端的改變。通過不同基因型與尼羅羅非魚生長性狀之間的多重比較結(jié)果顯示，雄性尼羅羅非魚AA基因型個體的全長、體長、體高、體厚、尾柄高和體重都顯著性大于AB基因型個體(P<0.5)。由此認為，AA基因型是雄性尼羅羅非魚生長的優(yōu)勢基因型，AB基因型則是雄性尼羅羅非魚生長的劣勢

7、基因型，可以嘗試將SNP位點(G42A)應(yīng)用于雄性尼羅羅非魚的標(biāo)記輔助選育。
　　 生肌決定因子6(Myogenic factor6，MYF6)是生肌決定因子家族的一員，在肌纖維中大量表達。該家族還有3個基因分別為Myf4，Myf5和MyoD，其中Myf5和MyoD基因共同作用于成肌細胞的生成，Myf6和Myf4基因共同作用于肌小管的分化。這4個基因之間相互配合，共同在肌肉的分化和形成過程中發(fā)揮作用。本研究利用RT-PCR和RA

8、CE方法成功分離尼羅羅非魚的MYF6基因，該基因cDNA全長為990 bp，最大開放閱讀框678 bp，編碼225個氨基酸。通過PCR-SSCP方法對尼羅羅非魚MYF6基因的CDS區(qū)域進行SNPs檢測，在引物M2的SSCP圖譜中呈現(xiàn)出多態(tài)性，將不同的帶型分別命名為AA、AB和BB基因型。通過測序發(fā)現(xiàn)MYF6基因第一外顯子部分存在一個SNP位點(G137T)，該位點沒有引起編碼氨基端的改變。通過不同基因型與尼羅羅非魚生長性狀之間的多重比較