西尼羅河病毒抗體競爭ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、西尼羅河病毒(West Nile Virus,WNV)和日本乙型腦炎病毒(JEV)同屬于黃病毒科黃病毒屬日本乙型腦炎病毒血清群,該群病毒屬于蚊媒病毒,主要由鳥類攜帶,經(jīng)蚊蟲傳播給人和馬等哺乳動物。WNV于1937年首次分離自非洲烏干達(dá)西尼羅河地區(qū)一名患病婦女血液中,1999年在美國紐約爆發(fā),引起人們恐慌和重大經(jīng)濟(jì)損失,國際獸醫(yī)局(OIE)已將其列為法定報告動物疫病。我國是JEV疫區(qū),兩者存在血清學(xué)交叉反應(yīng),為了防止WNV的入侵,排除可疑

2、病例,因此我們有必要建立起一種鑒別診斷方法作為技術(shù)儲備。
　　 囊膜蛋白E是WNV重要的結(jié)構(gòu)蛋白,其結(jié)構(gòu)域Ⅲ上含有WNV特異性的抗原表位,其主要的中和表位位于結(jié)構(gòu)域Ⅲ外表面的E307,E330,E332殘基上,該區(qū)域始終被認(rèn)為是與受體結(jié)合的區(qū)域,通過對這個區(qū)域的中和抗原表位識別可以區(qū)分JEV、黃熱病毒、登革熱病毒和墨累河谷腦炎病毒(MVEV)等一些黃病毒。
　　 根據(jù)GenBank上公布的WNV NY99毒株和JEV S

3、A14-14-2毒株序列,分別設(shè)計合成擴(kuò)增其E基因結(jié)構(gòu)域Ⅲ序列的特異性引物,通過PCR和RT-PCR分別擴(kuò)增E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ基因,長度分別為378bp和481bp。參照分子克隆實驗指南方法,將目的基因克隆到pET-32a(+)表達(dá)載體,經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定及測序證實了結(jié)構(gòu)域Ⅲ基因以正確的閱讀框架插入了pET-32a(+)載體。利用大腸桿菌BL21(DE3)菌株,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,運(yùn)用SDS-PAGE電泳分析可見其相對分子質(zhì)量

4、分別約為30kDa和35kDa,并通過His·Bind親和層析對重組蛋白進(jìn)行了純化。通過Western-blot和間接ELISA對本實驗室保存的3株單抗進(jìn)行特異性鑒定,篩選出特異性強(qiáng)的2株單抗(8F4A4,6H381),為建立能夠鑒別診斷JEV抗體和WNV抗體的競爭ELISA方法提供了競爭檢測抗體。
　　 以純化的WNV囊膜蛋白E結(jié)構(gòu)域Ⅲ作為抗原包被ELISA反應(yīng)板,單抗8F4A4作為競爭檢測抗體,通過方陣試驗確定了重組EⅢ蛋白

5、抗原的最佳包被濃度和單抗最佳稀釋度,同時改變血清稀釋倍數(shù)、包被條件及競爭反應(yīng)時間、封閉液、酶標(biāo)二抗稀釋度及作用時間、底物最佳作用條件等因素,確定了最佳反應(yīng)條件。結(jié)果表明:重組蛋白最佳包被濃度為530ng/mL,單抗的最佳稀釋倍數(shù)為1:8000,待檢血清的最佳稀釋倍數(shù)為1:10。本研究在國內(nèi)首次建立了檢測WNV抗體的競爭ELISA方法,特異性試驗證實該方法能夠與我國流行的JEV進(jìn)行鑒別診斷。對臨床56份陰性樣品進(jìn)行檢測計算出該方法的臨界值