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1、分類(lèi)號(hào):密級(jí):TS2074多重PCR快速檢測(cè)乳品方法研究單位代碼:學(xué)號(hào):10086OtO病原菌MultiplexPCRAssayforRapidDetectionofThreeBactedalPathogensinDairyFood學(xué)位申請(qǐng)人:武衛(wèi)影指導(dǎo)教師:張偉教授學(xué)位名稱(chēng):工程碩士研究領(lǐng)域:食品工程授予單位:;nIjL農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期:二。一二年五月二十日摘要食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來(lái)食品安全問(wèn)題的一個(gè)顯著特點(diǎn),在各種食品安全事
2、件中,細(xì)菌性食物中毒則是食物中毒的重要因素。目前,國(guó)內(nèi)檢測(cè)食品中病原菌主要采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法,其操作繁瑣,檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),通常需要35天才能完成,且靈敏度較低。因此,急需建立一種快速有效且通量較高的檢測(cè)方法。本文選擇沙門(mén)氏菌的invA基因,金黃色葡萄球菌的”甜c基因,小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的以fZ基因?yàn)榘谢?,分別設(shè)計(jì)了三對(duì)引物,試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)多重PCR反應(yīng)體系中退火溫度、引物添加量、M92濃度、dNTPs濃度及TaqDNA聚合酶添加量等影響
3、因素進(jìn)行優(yōu)化,確定了適宜的多重PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。研究了引物的特異性,確定了靈敏度,并探索了從食品中提取三種病原菌模板DNA的方法,檢測(cè)人工污染樣品,確定了檢出限,并與傳統(tǒng)檢測(cè)方法進(jìn)行了比較。多重PCR反應(yīng)體系為:10PCRbuffer2此,M92(25mmol/L)llaL,dNTPs(25raM)08IxL,Taq酶(5U/lxL)O3皿,;漠板各2此,上下游引物(10IAmol/L)各O8此,無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)齊至25此。多重PC
4、R擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃起始變性5min,94℃變性45S,57℃退火30S,72℃延伸50S,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán),最后一個(gè)循環(huán)于72。C延伸10rain。反應(yīng)產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,利用凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察結(jié)果。三對(duì)引物分別能擴(kuò)增出475bp,236bp,127bp的目的條帶,并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了DNA測(cè)序,登錄Genebank將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)上blast比對(duì),從而證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增產(chǎn)物。本研究共檢測(cè)了18株菌,其中4株沙門(mén)氏
5、菌、1株金黃色葡萄球菌、1株小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌均為陽(yáng)性結(jié)果;12株其他菌均為陰性結(jié)果,試驗(yàn)結(jié)果表明引物特異性強(qiáng)。確定了多重PCR的靈敏度,單獨(dú)檢測(cè)沙門(mén)氏菌靈敏度為:102CFU/mL、金黃色葡萄球菌靈敏度為:103CFU/mL、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌靈敏度為:103CFU/mL。同時(shí)能夠檢測(cè)出三種病原菌的靈敏度沙門(mén)氏菌為:103CFU/mL,金黃色葡萄球菌為:103CFU/mL,小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌為:103CFU/mL。本研究比較了6
6、種人工污染滅菌奶中模板DNA提取方法,從6種方法中,選取了一種快捷、有效的、適用的DNA提取方法。檢測(cè)人工污染樣品確定檢出限,多重PCR方法檢測(cè)人工污染巴氏殺菌奶中的三種致病菌,沙門(mén)氏菌檢出限為102CFU/mL、金黃色葡萄球菌檢出限為102CFU/mL、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢出限為102CFU/mL。并且檢測(cè)可以在6h內(nèi)完成,大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè),建立的多重PCR檢測(cè)方法對(duì)三種致病菌的敏感性均為100%;特異性:沙門(mén)
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