多重PCR快速檢測乳品中三種病原菌方法研究.pdf

1、分類號：密級：TS2074多重PCR快速檢測乳品方法研究單位代碼：學號：10086OtO病原菌MultiplexPCRAssayforRapidDetectionofThreeBactedalPathogensinDairyFood學位申請人：武衛(wèi)影指導教師：張偉教授學位名稱：工程碩士研究領域：食品工程授予單位：；nIjL農業(yè)大學答辯日期：二。一二年五月二十日摘要食品安全突發(fā)事件頻率高是近年來食品安全問題的一個顯著特點，在各種食品安全事

2、件中，細菌性食物中毒則是食物中毒的重要因素。目前，國內檢測食品中病原菌主要采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，其操作繁瑣，檢測時間較長，通常需要35天才能完成，且靈敏度較低。因此，急需建立一種快速有效且通量較高的檢測方法。本文選擇沙門氏菌的invA基因，金黃色葡萄球菌的”甜c基因，小腸結腸炎耶爾森氏菌的以fZ基因為靶基因，分別設計了三對引物，試驗過程中對多重PCR反應體系中退火溫度、引物添加量、M92濃度、dNTPs濃度及TaqDNA聚合酶添加量等影響

3、因素進行優(yōu)化，確定了適宜的多重PCR反應體系和擴增程序。研究了引物的特異性，確定了靈敏度，并探索了從食品中提取三種病原菌模板DNA的方法，檢測人工污染樣品，確定了檢出限，并與傳統(tǒng)檢測方法進行了比較。多重PCR反應體系為：10PCRbuffer2此，M92(25mmol／L)llaL，dNTPs(25raM)08IxL，Taq酶(5U／lxL)O3皿，；漠板各2此，上下游引物(10IAmol／L)各O8此，無菌雙蒸水補齊至25此。多重PC

4、R擴增程序為：94℃起始變性5min，94℃變性45S，57℃退火30S，72℃延伸50S，擴增30個循環(huán)，最后一個循環(huán)于72。C延伸10rain。反應產物在2％的瓊脂糖凝膠中進行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結果。三對引物分別能擴增出475bp，236bp，127bp的目的條帶，并對擴增產物進行了DNA測序，登錄Genebank將測序結果進行網上blast比對，從而證實PCR擴增產物確為目的擴增產物。本研究共檢測了18株菌，其中4株沙門氏

5、菌、1株金黃色葡萄球菌、1株小腸結腸炎耶爾森氏菌均為陽性結果；12株其他菌均為陰性結果，試驗結果表明引物特異性強。確定了多重PCR的靈敏度，單獨檢測沙門氏菌靈敏度為：102CFU／mL、金黃色葡萄球菌靈敏度為：103CFU／mL、小腸結腸炎耶爾森氏菌靈敏度為：103CFU／mL。同時能夠檢測出三種病原菌的靈敏度沙門氏菌為：103CFU／mL，金黃色葡萄球菌為：103CFU／mL，小腸結腸炎耶爾森氏菌為：103CFU／mL。本研究比較了6

6、種人工污染滅菌奶中模板DNA提取方法，從6種方法中，選取了一種快捷、有效的、適用的DNA提取方法。檢測人工污染樣品確定檢出限，多重PCR方法檢測人工污染巴氏殺菌奶中的三種致病菌，沙門氏菌檢出限為102CFU／mL、金黃色葡萄球菌檢出限為102CFU／mL、小腸結腸炎耶爾森氏菌檢出限為102CFU／mL。并且檢測可以在6h內完成，大大縮短了檢測時間。對實際樣品進行檢測，建立的多重PCR檢測方法對三種致病菌的敏感性均為100％；特異性：沙門