紫花苜蓿MsRBP基因的克隆及其功能鑒定.pdf

1、轉錄后調控是基因表達過程中重要的調節(jié)機制之一，影響著植物正常的生長發(fā)育和抗逆等生命過程。RNA結合蛋白(RBPs)是轉錄后水平調控基因表達的主要承擔者，普遍存在于各種生物體中。它通過直接結合或間接調控而廣泛的參與到轉錄后調節(jié)的多個環(huán)節(jié)，在RNA加工過程中發(fā)揮著極其重要的作用。迄今，已從許多植物中克隆得到了大量不同種類的RNA結合蛋白，有研究表明，RNA結合蛋白參與植物的多種脅迫應答過程。但至今未見有關紫花苜蓿RNA結合蛋白研究的相關報道

2、。
　　 本研究以紫花苜蓿耐鹽品種“中苜一號”為材料，根據(jù)表達序列標簽(EST)(GenBank accession No.FE896907.1)序列，采用RACE技術克隆得到了紫花苜蓿RNA結合蛋白基因的全長序列，并通過生物信息學和分子生物學等分析方法和技術進一步對該基因的結構、功能進行了初步鑒定。主要結果如下:
　　 1)利用RACE技術，克隆得到了一個編碼紫花苜蓿RNA結合蛋白基因的全長cDNA序列，命名為MsRB

3、P(GenBank accession No.JN986878.1)。生物信息學分析表明，該基因全長1551 bp，包含一個1230 bp的完整開放閱讀框，5'端非編碼區(qū)(UTR)長69 bp，3'端UTR長252 bp。該基因編碼長度為409個氨基酸的蛋白，其理論分子量為45.6 kDa，等電點為6.31。表達的蛋白質N端含有3個RRM型RNA結合結構域，C端為一個谷氨酰胺和脯氨酸富含結構域。
　　 2)成功構建了瞬時融合表達

4、載體pA7-GFP-MsRBP，亞細胞定位分析結果顯示MsRBP編碼蛋白定位于細胞核。
　　 3)對MsRBP基因在不同脅迫條件下的表達特性進行了分析。實時熒光定量PCR結果表明:300mMNaCl、20％ PEG6000和100μM ABA均能誘導MsRBP基因表達量上調;300mMNaCl處理初期（4h前），MsRBP表達量上升并不明顯，10h時達到最大值，這一變化在根中表現(xiàn)的尤為突出;ABA和PEG處理時，MsRBP表達量

5、在短時間內(2h-4h)急劇上升，處理24h時其表達仍高于對照，表明該基因對ABA和PEG非常敏感且持續(xù)時間較長。
　　 4)成功構建了植物超表達載體pBI121-MsRBP，并利用農(nóng)桿菌介導的方法在煙草NC89和紫花苜?！爸熊僖惶枴敝羞M行了過量表達。經(jīng)抗性篩選和分子檢測分析，分別得到了3株陽性再生轉基因煙草和2株陽性再生轉基因苜蓿。
　　 5)利用農(nóng)桿菌介導的花序浸染法轉化擬南芥，并經(jīng)過三次抗性篩選和分子檢測分析，得到