紫花苜蓿MsRBP基因的克隆及其功能鑒定.pdf

1、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是基因表達(dá)過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)機(jī)制之一，影響著植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆等生命過(guò)程。RNA結(jié)合蛋白(RBPs)是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的主要承擔(dān)者，普遍存在于各種生物體中。它通過(guò)直接結(jié)合或間接調(diào)控而廣泛的參與到轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的多個(gè)環(huán)節(jié)，在RNA加工過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用。迄今，已從許多植物中克隆得到了大量不同種類(lèi)的RNA結(jié)合蛋白，有研究表明，RNA結(jié)合蛋白參與植物的多種脅迫應(yīng)答過(guò)程。但至今未見(jiàn)有關(guān)紫花苜蓿RNA結(jié)合蛋白研究的相關(guān)報(bào)道

2、。
　　 本研究以紫花苜蓿耐鹽品種“中苜一號(hào)”為材料，根據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)(GenBank accession No.FE896907.1)序列，采用RACE技術(shù)克隆得到了紫花苜蓿RNA結(jié)合蛋白基因的全長(zhǎng)序列，并通過(guò)生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等分析方法和技術(shù)進(jìn)一步對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行了初步鑒定。主要結(jié)果如下:
　　 1)利用RACE技術(shù)，克隆得到了一個(gè)編碼紫花苜蓿RNA結(jié)合蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為MsRB

3、P(GenBank accession No.JN986878.1)。生物信息學(xué)分析表明，該基因全長(zhǎng)1551 bp，包含一個(gè)1230 bp的完整開(kāi)放閱讀框，5'端非編碼區(qū)(UTR)長(zhǎng)69 bp，3'端UTR長(zhǎng)252 bp。該基因編碼長(zhǎng)度為409個(gè)氨基酸的蛋白，其理論分子量為45.6 kDa，等電點(diǎn)為6.31。表達(dá)的蛋白質(zhì)N端含有3個(gè)RRM型RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端為一個(gè)谷氨酰胺和脯氨酸富含結(jié)構(gòu)域。
　　 2)成功構(gòu)建了瞬時(shí)融合表達(dá)

4、載體pA7-GFP-MsRBP，亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示MsRBP編碼蛋白定位于細(xì)胞核。
　　 3)對(duì)MsRBP基因在不同脅迫條件下的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明:300mMNaCl、20％ PEG6000和100μM ABA均能誘導(dǎo)MsRBP基因表達(dá)量上調(diào);300mMNaCl處理初期（4h前），MsRBP表達(dá)量上升并不明顯，10h時(shí)達(dá)到最大值，這一變化在根中表現(xiàn)的尤為突出;ABA和PEG處理時(shí)，MsRBP表達(dá)量

5、在短時(shí)間內(nèi)(2h-4h)急劇上升，處理24h時(shí)其表達(dá)仍高于對(duì)照，表明該基因?qū)BA和PEG非常敏感且持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。
　　 4)成功構(gòu)建了植物超表達(dá)載體pBI121-MsRBP，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法在煙草NC89和紫花苜?！爸熊僖惶?hào)”中進(jìn)行了過(guò)量表達(dá)。經(jīng)抗性篩選和分子檢測(cè)分析，分別得到了3株陽(yáng)性再生轉(zhuǎn)基因煙草和2株陽(yáng)性再生轉(zhuǎn)基因苜蓿。
　　 5)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥，并經(jīng)過(guò)三次抗性篩選和分子檢測(cè)分析，得到