紫花苜蓿無序蛋白MsZFP基因的克隆及功能研究.pdf

1、固有無序蛋白是一類存在多種動態(tài)互變結構，具有正常的生物學活性的蛋白質。在分子調(diào)控網(wǎng)絡中，固有無序蛋白通過與多種分子結合，引入復雜的多樣性互作，進而在植物適應逆境和脅迫應答方面起到重要作用。MsZFP是一種轉錄因子具有手指狀結構域，通過生物信息學預測其為固有無序蛋白，在細胞分化、基因表達調(diào)控、胚胎發(fā)育、增強植物脅迫的耐受性等方面具有重要作用。本研究從紫花苜蓿（Medicago sativa L）中克隆得到MsZFP基因，對煙草進行遺傳轉化

2、，為MsZFP基因功能及紫花苜?？鼓鏅C理的研究奠定基礎。主要研究結果如下：
　　1. MsZFP基因的克隆與序列分析
　　通過RT-PCR方法克隆了MsZFP基因，該基因含有762 bp的開放讀碼框，編碼253個氨基酸。具有2個保守的單C2H2型結構域。對其開放讀碼框氨基酸進行無序性分析，發(fā)現(xiàn)其為固有無序蛋白。通過與其它物種中MsZFP近源基因的比對及進化樹構建發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿MsZFP基因與蒺藜苜蓿、大豆、花生等物種中近源基

3、因的親緣關系較近。
　　2. pCBM-MsZFP植物表達載體的構建
　　構建了含有MsZFP基因的植物表達載體pCBM-35S-MsZFP，含有草丁膦篩選標記基因PPT和組成型啟動子35S。
　　3. MsZFP基因對煙草的遺傳轉化
　　通過農(nóng)桿菌介導法將MsZFP基因轉入煙草,獲得43株PPT抗性植株。對植株基因組DNA進行PCR鑒定，獲得25株陽性植株。通過實時定量PCR對陽性植株基因表達量進行檢測，結果表

4、明，轉基因株系OX3、OX15、OX23中MsZFP的表達量比較高。
　　4.對轉基因煙草的抗逆性分析
　　將野生型（WT）和轉基因煙草置于-4℃處理2 h，觀察到WT葉片明顯萎蔫，其相對電導率明顯高于轉基因煙草。在0℃低溫脅迫處理下，轉基因煙草的丙二醛含量明顯低于WT，脯氨酸、可溶性蛋白含量明顯高于WT。表明MsZFP基因可以提高植物的耐寒能力。
　　將WT和轉基因煙草相同部位葉圓片浸泡于300 mM NaCl溶液，