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文檔簡介
1、固有無序蛋白是一類存在多種動態(tài)互變結(jié)構(gòu),具有正常的生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。在分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,固有無序蛋白通過與多種分子結(jié)合,引入復(fù)雜的多樣性互作,進(jìn)而在植物適應(yīng)逆境和脅迫應(yīng)答方面起到重要作用。MsZFP是一種轉(zhuǎn)錄因子具有手指狀結(jié)構(gòu)域,通過生物信息學(xué)預(yù)測其為固有無序蛋白,在細(xì)胞分化、基因表達(dá)調(diào)控、胚胎發(fā)育、增強植物脅迫的耐受性等方面具有重要作用。本研究從紫花苜蓿(Medicago sativa L)中克隆得到MsZFP基因,對煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化
2、,為MsZFP基因功能及紫花苜??鼓鏅C理的研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
1. MsZFP基因的克隆與序列分析
通過RT-PCR方法克隆了MsZFP基因,該基因含有762 bp的開放讀碼框,編碼253個氨基酸。具有2個保守的單C2H2型結(jié)構(gòu)域。對其開放讀碼框氨基酸進(jìn)行無序性分析,發(fā)現(xiàn)其為固有無序蛋白。通過與其它物種中MsZFP近源基因的比對及進(jìn)化樹構(gòu)建發(fā)現(xiàn),紫花苜蓿MsZFP基因與蒺藜苜蓿、大豆、花生等物種中近源基
3、因的親緣關(guān)系較近。
2. pCBM-MsZFP植物表達(dá)載體的構(gòu)建
構(gòu)建了含有MsZFP基因的植物表達(dá)載體pCBM-35S-MsZFP,含有草丁膦篩選標(biāo)記基因PPT和組成型啟動子35S。
3. MsZFP基因?qū)煵莸倪z傳轉(zhuǎn)化
通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將MsZFP基因轉(zhuǎn)入煙草,獲得43株P(guān)PT抗性植株。對植株基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定,獲得25株陽性植株。通過實時定量PCR對陽性植株基因表達(dá)量進(jìn)行檢測,結(jié)果表
4、明,轉(zhuǎn)基因株系OX3、OX15、OX23中MsZFP的表達(dá)量比較高。
4.對轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性分析
將野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因煙草置于-4℃處理2 h,觀察到WT葉片明顯萎蔫,其相對電導(dǎo)率明顯高于轉(zhuǎn)基因煙草。在0℃低溫脅迫處理下,轉(zhuǎn)基因煙草的丙二醛含量明顯低于WT,脯氨酸、可溶性蛋白含量明顯高于WT。表明MsZFP基因可以提高植物的耐寒能力。
將WT和轉(zhuǎn)基因煙草相同部位葉圓片浸泡于300 mM NaCl溶液,
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