轉(zhuǎn)Cry1Ab基因水稻側(cè)翼序列的擴(kuò)增和轉(zhuǎn)化體特異事件檢測(cè).pdf

1、近年來，全國(guó)轉(zhuǎn)基因作物研究的迅速發(fā)展成功的解決了作物的抗病蟲及抗逆等問題，同時(shí)也為其他問題的解決提供了很好的途徑。除了獲得了目標(biāo)性狀外，轉(zhuǎn)基因作物由于外源基因的插入可能會(huì)影響原有的基因網(wǎng)絡(luò)，引起轉(zhuǎn)基因植物的生理生化變化及代謝途徑的改變，進(jìn)而使轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生非預(yù)期效應(yīng)，成為糧食食用安全問題的潛在威脅因素。轉(zhuǎn)基因作物潛在的安全性問題引起了人們廣泛的關(guān)注，各國(guó)相繼出臺(tái)了相關(guān)的轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)管理法規(guī)，因此，作為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全檢測(cè)的研究顯得尤為重要。

2、本研究以共轉(zhuǎn)化獲得的不含篩選標(biāo)記的44株轉(zhuǎn)Cry1Ab基因水稻為材料，對(duì)外源基因在水稻染色體上的插入位點(diǎn)進(jìn)行了分析，為轉(zhuǎn)Cry1Ab基因水稻的代謝途徑的研究做準(zhǔn)備，同時(shí)也為其環(huán)境釋放安全檢測(cè)提供理論參考。
　　通過改進(jìn)熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(TAIL-PCR)方法，使用5個(gè)簡(jiǎn)并引物對(duì)44個(gè)轉(zhuǎn)Cry1Ab基因水稻株系進(jìn)行擴(kuò)增，成功地分離并測(cè)定了36個(gè)株系的側(cè)翼序列，成功率約為82％。利用生物信息學(xué)分析轉(zhuǎn)Cry1Ab基因水稻外源插入基因的

3、分子特征，結(jié)果表明這些植株大體上來自于四個(gè)轉(zhuǎn)化事件，其中有24個(gè)材料屬于第一個(gè)轉(zhuǎn)化事件，其整合位點(diǎn)在第二號(hào)染色體上，有3個(gè)材料屬于第二個(gè)轉(zhuǎn)化事件，這些植株的側(cè)翼序列與水稻基因組中不同染色體序列具有高度同源性，有6個(gè)樣品屬于第三個(gè)轉(zhuǎn)化事件，為多拷貝植株，有3個(gè)樣品屬于第四個(gè)轉(zhuǎn)化事件，為串聯(lián)重復(fù)拷貝的植株，這些側(cè)翼序列的獲得為后期研究和評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)Cry1Ab基因水稻可能產(chǎn)生的非預(yù)期效應(yīng)提供了必要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)Cry1Ab基因抗蟲水稻Bt01已申

4、請(qǐng)進(jìn)行環(huán)境釋放試驗(yàn)，通過southern雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明轉(zhuǎn)Cry1Ab基因抗蟲水稻Bt01為單拷貝植株。建立的轉(zhuǎn)Cry1Ab基因抗蟲水稻Bt01的轉(zhuǎn)化體特異性定性、定量檢測(cè)方法，經(jīng)實(shí)驗(yàn)得出轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測(cè)體系的最低鑒定極限為10個(gè)拷貝，定量PCR檢測(cè)體系的LOD為5個(gè)拷貝，LOQ為10個(gè)拷貝。結(jié)果表明：本研究建立的事件特異性定性與定量檢測(cè)方法適用于轉(zhuǎn)Cry1Ab基因抗蟲水稻Bt01定性和定量檢測(cè)，并且具有穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)和