水稻變異株系中玉米DNA側(cè)翼序列的研究.pdf

1、本研究是利用本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的遠(yuǎn)緣分子雜交技術(shù)將玉米DNA直接導(dǎo)入水稻細(xì)胞,于2000年獲得了具有玉米氣生根性狀的水稻變異株系,選取穩(wěn)定遺傳八代的水稻變異株系08-7(+2)-131-5-2作為研究材料,通過AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對變異株系08-7(+2)-131-5-2和陽性對照(玉米:鄭單14)、陰性對照(香稻一號)進(jìn)行DNA多態(tài)性分析,從變異株系中篩選出1條與陽性對照玉米相同的DNA條帶,對該條帶進(jìn)行回收、克隆和測序得到一條長為349b

2、p的序列,NCBI上對測序結(jié)果進(jìn)行Blast n相似性搜索,發(fā)現(xiàn)該序列與玉米序列(ref｜NM_001155903.1)的相似率為100％,根據(jù)玉米序列設(shè)計(jì)了一對Nested引物P5M3 Sense和Anti Sense-P5M3對陽性對照和變異株系驗(yàn)證,對目的帶進(jìn)行膠回收并測序,獲得長為212bp的條帶,經(jīng)DNAman比對陽性對照與變異株系的一致率為99.53％,僅有一個(gè)堿基差別,經(jīng)Blast檢索進(jìn)一步確定該序列為玉米序列。
　

3、　 運(yùn)用TAIL-PCR技術(shù)對已知目的序列的未知側(cè)翼序列進(jìn)行延伸,根據(jù)上述已知目的帶的DNA序列分別設(shè)計(jì)3條特異嵌套引物SP1;SP2;SP3,根據(jù)已知DNA序列對應(yīng)的蛋白質(zhì)(NCBI上進(jìn)行Blastp檢索半胱氨酸二硫鍵內(nèi)切酶/泛素蛋白,根據(jù)蛋白質(zhì)的保守序列設(shè)計(jì)兼并引物)序列設(shè)計(jì)了5條兼并引物即Tail-AD1;Tail-AD2;Tail-AD3;Tail-AD4;Tail-AD5,分別用3條特異引物與5條兼并引物中的任意一條進(jìn)行組合

4、,通過優(yōu)化引物對的組合及反應(yīng)體系,其中兼并引物Tail-AD3與特異引物的組合所得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。經(jīng)測序得到了一段長為2123bp的DNA序列,進(jìn)一步在MaizeGDB中檢索該序列,結(jié)果顯示該序列位于玉米2號染色體上,匹配率為94％,NCBI上Blastp檢索顯示其序列位于玉米mRNA NM-001155903序列中(編碼半胱氨酸二硫鍵內(nèi)切酶/泛素蛋白),經(jīng)生物軟件DNAman分析該DNA序列編碼1條449個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)序列,命名為