腸炎沙門菌和雛沙門菌fimH基因缺失株的構(gòu)建及相關(guān)功能性分析.pdf

1、腸炎沙門菌是一種重要的人畜共患病病原菌，具有廣泛的宿主譜，能引起人和動物腸道或全身性疾病。雛沙門菌屬于專嗜性病原菌，可引起不同日齡的雞感染發(fā)病，耐受雞長期帶菌且生長發(fā)育遲緩，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時也嚴(yán)重威脅人和動物的健康。
　　沙門菌屬經(jīng)口感染宿主，然后通過對腸上皮細(xì)胞或位于派氏結(jié)淋巴組織的侵襲，將感染的吞噬細(xì)胞移動到淋巴細(xì)胞，細(xì)菌在此開始繁殖。在此過程中，沙門菌對宿主細(xì)胞的黏附是引起宿主致病的先決條件。鑒于FimH的功

2、能研究大多集中在尿道致病性大腸桿菌(Uropathogenic Escherichia coli，UPEC)對尿道表皮細(xì)胞的黏附方面，而對腸炎沙門菌和雛沙門菌致病進(jìn)程中FimH所參與的生物學(xué)功能卻鮮有報道。本研究以Ⅰ型菌毛fimH基因?yàn)榍腥朦c(diǎn)，探究其在腸炎沙門菌和雛沙門菌中所發(fā)揮的生物學(xué)功能。
　　通過構(gòu)建腸炎沙門菌Ⅰ型菌毛主要亞單位FimA原核表達(dá)載體，并制備鼠源多克隆抗體，利用Western-Blot驗(yàn)證腸炎沙門菌和雛沙門菌Ⅰ

3、型菌毛的表達(dá)。本研究通過比對GenBank上沙門菌Ⅰ型菌毛fimH基因序列，設(shè)計一對PCR引物擴(kuò)增腸炎沙門菌CMCC(B)50336和雛沙門菌15218Ⅰ型菌毛的fimH基因序列，根據(jù)PCR測序結(jié)果設(shè)計一對同源重組引物，其5'端與fimH基因序列兩側(cè)同源，而3'端與氯霉素抗性基因cat表達(dá)盒同源。利用λ噬菌體-Red同源重組系統(tǒng)對腸炎沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株CMCC(B)50336和雛沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株15218的fimH基因進(jìn)行敲除。首先，以質(zhì)粒pKD

4、3為模板擴(kuò)增含有氯霉素抗性的PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化后分別電轉(zhuǎn)化至含質(zhì)粒pKD46的腸炎沙門菌CMCC(B)50336和雛沙門菌15218中，在Red同源重組酶Exo、Beta、Gam的作用下，含有氯霉素抗性基因片段的產(chǎn)物借助兩翼同源序列與染色體上的靶基因發(fā)生重組，置換fimH基因，分別獲得一次重組菌50336△fimH∷cat和15218△fimH∷ cat。在二次重組中，將編碼FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20分別電轉(zhuǎn)化入50336 fimH∷

5、 cat、15218△fimH∷cat突變株中，通過對cat
　　閱讀框兩側(cè)的FLP位點(diǎn)的識別，從而消除氯霉素抗性基因。最后通過PCR檢測和DNA測序結(jié)果，驗(yàn)證缺失株50336△ fimH和15218△ fimH成功構(gòu)建。血凝試驗(yàn)和酵母凝集試驗(yàn)表明，腸炎沙門菌能發(fā)生明顯的凝集現(xiàn)象，而fimH缺失突變株喪失凝集能力。生物被膜定性和定量試驗(yàn)證明FimH促進(jìn)腸炎沙門菌生物被膜的形成。此外，在腸炎沙門菌中，F(xiàn)imH促進(jìn)對禽巨噬細(xì)胞HD-1