鴨源鼠傷寒沙門氏菌基因缺失株的構建及免疫評價.pdf

1、鴨沙門氏菌病，俗稱鴨傷寒病。是雛鴨、肉鴨、番鴨、櫻桃谷鴨等多種家禽的急性或慢性傳染病。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為患鴨精神沉郁、食欲廢絕、腿軟、腳掌發(fā)干，出現(xiàn)乍毛、下白痢等，發(fā)病率和死亡率可分別高達75％和60％。
　　鴨沙門氏菌病的病原為沙門氏菌屬中的一些血清型，最常見的是鼠傷寒沙門氏菌，占75％～95％;其次是腸炎沙門氏菌，約占11.3％;鴨沙門氏菌，約占4.7％;雞白痢沙門氏菌約占1％。目前對禽類沙門氏菌病的研究主要是集中在陸禽（雞

2、），受感染的雞肉和雞蛋能夠經(jīng)食物鏈將沙門氏菌傳染給人。與歐洲以及美洲多數(shù)國家不同的是，我國是傳統(tǒng)的鴨養(yǎng)殖與消費大國，鴨肉以及鴨蛋的產量居于全世界第一位，因此，我國居民因食用受污染的鴨肉以及鴨蛋而感染沙門氏菌病的幾率較其他國家會更高。
　　本文對沙門氏菌快速檢測方法、我國部分地區(qū)肉鴨沙門氏菌流行情況、鴨源鼠傷寒沙門氏菌基因缺失減毒株構建及疫苗用前景評價等開展研究，獲得了以下的研究結果:
　　1.建立了基于fimY基因的沙門氏菌

3、屬特異性LAMP檢測方法(fimY-LAMP)
　　通過多重序列比對，我們在fimY基因的保守區(qū)域設計了3對引物，建立了fim Y-LAMP檢測法。該方法在純培養(yǎng)條件下每反應管能夠分別檢測到6.0 CFU以及4.8 CFU的腸炎沙門氏菌(S.enterica)和鴨沙門氏菌(S.anatis)，而常規(guī)的PCR檢測法只能分別檢測到60 CFU以及48 CFU的腸炎沙門氏菌和鴨沙門氏菌。此外，在有外源DNA干擾如:人工混入0.01g鴨肝

4、臟或脾臟DNA的條件下，fim Y-LAMP法每反應管仍然能夠檢測到6.0 CFU的腸炎沙門氏菌。
　　2.我國部分地區(qū)鴨源沙門氏菌的檢測、分離和鑒定
　　運用fimY-LAMP法對臨床采集或送檢的部分樣本進行了沙門氏菌的快速檢測，結果表明178份樣本（115份鴨肝臟以及63份鴨脾臟樣本）中有12份樣本的檢測結果為陽性。進一步分離，我們得到了12株沙門氏菌。此外，從部分地區(qū)采集的153份健康鴨的肛門拭子中，我們分離得到了6株

5、沙門氏菌。全部18株沙門氏菌血清型鑒定結果均為鼠傷寒沙門氏菌。
　　3.鴨源鼠傷寒沙門氏插入突變株和完全缺失株構建
　　從18株鴨源鼠傷寒沙門氏菌中篩選得到一株不含有氨芐、卡那、氯霉素以及四環(huán)素抗性的鼠傷寒沙門氏菌，命名為TT-1。以TT-1作為親本株構建了7個含有四環(huán)素抗性的插入突變株，分別為:TT-3(△hilA∷tetRA)、TT-4(△ssrB∷tetRA)、TT-5(△pho P/phoQ∷tetRA)、TT-6(

6、△ompR∷tetRA)、TT-7(△rpoS∷tetRA)、TT-8(△slyA∷tetRA)以及TT-9(△clpP∷tetRA);7個消除了四環(huán)素抗性的完全缺失株，分別為:TT-17(△hilA)、TT-18(△ssrB)、TT-19(△phoP/pho Q)、TT-20(△ompR)、TT-21(△rpoS)、TT-22(△slyA)以及TT-23(△clpP)。
　　4.親本株及缺失株毒力、缺失株在鴨體內的定殖與代謝

7、r>　　親本株TT-1對1日齡雛鴨的口服LD50值為1.2×108CFU。敲除了hilA、slyA或者rpoS基因的缺失株TT-17(△hilA)、TT-22(△slyA)以及TT-21(△rpoS)對1日齡雛鴨的減毒效果并不明顯，而ssrB、phoP/phoQ、ompR以及clpP基因缺失后的菌株TT-18(△ssrB)、TT-19(△phoP/phoQ)、TT-20(△ompR)以及TT-23(△clpP)對1日齡雛鴨的減毒效果十分

8、明顯，4個缺失株的口服LD50值均大于100倍親本株TT-1的口服LD50值。
　　用含有四環(huán)素抗性的插入突變株TT-4(△ssrB∷tetRA)、TT-5(△pho P/phoQ∷tetRA)、TT-6（△ompR∷tetRA）以及TT-9(△clpP∷tetRA)來分別模擬TT-18(△ssrB)、TT-19(△phoP/phoQ)、TT-20(△ompR)以及TT-23(△clpP)這4個缺失株在鴨子體內主要靶器官肝臟和脾臟

9、的定殖和代謝情況。結果表明雖然TT-18(△ssrB)、TT-20(△ompR)以及TT-23(△clpP)這三個缺失株對1日齡雛鴨的毒力降低了，但是它們仍然能夠定殖在鴨子的肝臟和脾臟。其中TT-4(△ssrB∷tetRA)突變株在鴨子肝臟和脾臟的停留時間超過了28天，表現(xiàn)出潛伏感染的特性。而TT-5(△pho P/phoQ∷tetRA)突變株在整個試驗周期內一直無法定殖于鴨子的肝臟和脾臟。
　　5.疫苗候選株TT-18(△ssr

10、B)、TT-19(△phoP/phoQ)、TT-20(△ompR)以及TT-23(△clpP)的免疫保護力
　　我們觀察到1日齡雛鴨在口服免疫了106CFU的TT-18(△ssrB)、TT-19(△phoP/phoQ)、TT-20(△ompR)或者TT-23(△clpP)后第7天均能100％的抵御1010CFU野毒株TT-1的口服感染，而陰性對照組則有60％的鴨子死亡。1日齡雛鴨口服接種了108CFU的TT-18(△ssrB)或T

11、T-23(△clpP)缺失株后第7天分別有85％和80％的雛鴨能夠抵御1010CFU野毒株TT-1的口服感染。
　　6.建立了基于鼠傷寒沙門氏菌外膜蛋白的ELISA檢測法，并運用該方法對免疫鴨子血清中的特異性IgM、IgG以及膽汁中特異性的IgA抗體進行了分時檢測，同時還對誘導產生的功能性抗體進行了相應評價
　　對疫苗株TT-18(△ssrB)、TT-19(△phoP/phoQ)、TT-20(△ompR)以及TT-23(△c

12、lpP)進行體液免疫評價時，我們發(fā)現(xiàn)這4個缺失株均能誘導鴨子產生特異性的IgM，IgG以及IgA抗體。其中特異性的IgM抗體產生的時間最早，于感染后第5天便能夠在免疫鴨子的血清中被檢測到;IgG其次，于免疫后第7天出現(xiàn)在免疫鴨子的血清中;特異性IgA抗體出現(xiàn)的時間最晚，于感染后第14天才從免疫鴨子的膽汁中被檢測到。對比不同菌株誘導產生的特異性抗體滴度，我們發(fā)現(xiàn)在鴨子體內停留時間較長的TT-18(△ssrB)以及TT-23(△clpP)缺

13、失株刺激鴨子產生的特異性抗體的滴度和維持的時間也較長。而在鴨體內停留時間較短或無法停留的TT-20(△ompR)和TT-19(△phoP/phoQ)刺激鴨機體產生的特異性抗體的滴度和維持的時間也較短。與ELISA檢測結果稍有不同的是，誘導相對較少特異性抗體的TT-20(△ompR)缺失株卻誘導了較多的功能性抗體，其誘導的免疫血清對親本株TT-1的生長抑制作用較TT-18(△ssrB)、TT-19(△phoP/phoQ)、以及TT-23(

14、△clpP)試驗組更加顯著(P＜0.01)。
　　7.應用ELISA方法對免疫鴨子血清中IFN-、IL-2、IL-4的含量進行了分時檢測
　　在免疫了TT-18(△ssrB)、TT-19(△phoP/phoQ)、TT-20(△ompR)以及TT-23(△clpP)后不同的時間點，我們采集了免疫鴨子的血液，分離血清后檢測了其中IFN-γ、IL-2、IL-4的含量。結果表明免疫鴨子血清IL-2的含量在免疫后第3天開始增加，而第7