腸炎沙門氏菌非編碼小RNA micC基因缺失株的構(gòu)建及其相關(guān)功能研究.pdf

1、沙門氏菌屬是一群寄生于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的無芽胞直桿菌，絕大多數(shù)沙門氏菌對(duì)人和動(dòng)物都有致病性，能引起人和動(dòng)物的多種不同臨床表現(xiàn)的沙門氏菌病，且為人類食物中毒的主要病原之一，在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)和公共衛(wèi)生上均十分重要。腸炎沙門氏菌屬于沙門氏菌屬，它主要引起畜禽的胃腸炎、人類腸炎和食物中毒，其中對(duì)家禽的感染主要發(fā)生于肉雞、蛋雞中。如今，腸炎沙門氏菌引起的病例比例不斷上升，嚴(yán)重影響了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，并且威脅著人類的健康，引起了公共衛(wèi)生很大的關(guān)注。
　

2、　 隨著對(duì)細(xì)菌sRNA研究的深入及生物信息學(xué)技術(shù)的逐漸成熟，在沙門氏菌中大約發(fā)現(xiàn)70種沙門菌sRNA。這些sRNA能夠識(shí)別溫度、滲透壓、pH值等環(huán)境的信號(hào)，與mRNA或者特定的蛋白質(zhì)結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)菌的翻譯過程及蛋白質(zhì)的活性。micC是存在于沙門氏菌中的一種sRNA基因，它能夠在分子伴侶Hfq蛋白的輔助下阻止核糖體與外膜蛋白mRNA的結(jié)合，進(jìn)而對(duì)外膜蛋白的翻譯過程起到調(diào)控作用。本文將從以下幾個(gè)方面對(duì)sRNAmicC基因的功能進(jìn)行探索性的研

3、究。
　　 1腸炎沙門氏菌sRNAmicC缺失株及其回補(bǔ)株的構(gòu)建
　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌micC基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR克隆了腸炎沙門氏菌50336micC基因，通過Red同源重組系統(tǒng)對(duì)腸炎沙門氏菌micC基因進(jìn)行敲除，構(gòu)建出腸炎沙門氏菌50336△micC缺失株。并通過重組子的構(gòu)建，成功構(gòu)建出回補(bǔ)株50336△micC::micC，體外重組表達(dá)micC基因，為micC基因功能的研究提供了有價(jià)值的素材。構(gòu)建程序?yàn)?/p>

4、:以質(zhì)粒pKD3為模板，PCR擴(kuò)增出含氯霉素抗性、具有和micC基因上下游序列同源的融合PCR片段，轉(zhuǎn)化入含重組質(zhì)粒pKD46的腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)株50336中，融合PCR片段在pKD46表達(dá)的重組酶的作用下，氯霉素抗性基因與micC基因發(fā)生同源重組，抗性基因cat替換靶基因micC，氯霉素抗性的平板篩選出陽性克隆50336△micC::cat，進(jìn)一步利用pCP20編碼的Flp重組酶進(jìn)行第二次重組，消除氯霉素抗性基因，獲得腸炎沙門氏菌基因

5、缺失株50336△micC。將構(gòu)建的缺失株50336△micC進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序檢測，證實(shí)缺失株構(gòu)建正確。以標(biāo)準(zhǔn)株50336為模板，PCR擴(kuò)增micC基因，利用micC基因序列兩端引入的NheⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，將micC基因克隆到表達(dá)載體pBR322中構(gòu)建重組表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化入突變株50336△micC，成功構(gòu)建回補(bǔ)株。Red同源重組系統(tǒng)對(duì)于一次重組的PCR產(chǎn)物及感受態(tài)細(xì)胞要求很高，重組率比較低，但二次重組的效率很高，利用此系

6、統(tǒng)成功構(gòu)建的缺失株50336△micC以及回補(bǔ)株50336△micC::micC為進(jìn)一步研究sRNAmicC基因的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 2腸炎沙門氏菌外膜蛋白OmpD的生物活性表達(dá)及多抗血清的制備
　　 本實(shí)驗(yàn)利用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出可溶性的腸炎沙門氏菌外膜蛋白OmpD，制備了抗外膜蛋白OmpD的多抗血清。制備程序?yàn)?據(jù)腸炎沙門氏菌外膜蛋白OmpD基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,通過PCR技術(shù)從國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株50336中擴(kuò)增omp

7、D基因，并按預(yù)定的閱讀框插入表達(dá)性載體pColdTMTF中，獲得重組質(zhì)粒pColdTMTF-ompD，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切消化后瓊脂糖凝膠電泳分析及序列測定的結(jié)果表明，該序列大小為1089bp，與已發(fā)表的ompD結(jié)構(gòu)編碼序列完全一致。重組質(zhì)粒pColdTMTF-ompD轉(zhuǎn)化大腸桿菌EcoliBL21(DE3)并能高效誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE分析鑒定菌體裂解上清液，該重組菌可以表達(dá)大小為82kD的可溶性重組蛋白OmpD-TF。純化Om

8、pD-TF免疫小鼠制備多抗血清，間接ELISA法鑒定多抗血清效價(jià)為2.6×105，抗外膜蛋白OmpD多抗血清的制備為進(jìn)一步研究micC基因?qū)τ谕饽さ鞍譕mpD的調(diào)控機(jī)制提供了有利的工具。
　　 3腸炎沙門氏菌sRNAmicC功能探索分析
　　 本實(shí)驗(yàn)利用熒光定量PCR和Western-blotting技術(shù)，檢測了sRNAmicC基因?qū)δc炎沙門氏菌外膜蛋白OmpD表達(dá)量的影響，以腹腔注射為感染途徑，測定了標(biāo)準(zhǔn)株50336、

9、缺失株50336△micC、回補(bǔ)株50336△micC::micC對(duì)6周齡Balb/c小鼠的半數(shù)致死量(LD50)，從而對(duì)sRNAmicC基因的功能進(jìn)行探索。熒光定量PCR結(jié)果分析，與野生株相比，缺失株及回補(bǔ)株外膜蛋白OmpD的表達(dá)量沒有顯著變化，這一結(jié)果可能由于micC基因調(diào)控的是翻譯過程，而不是轉(zhuǎn)錄過程;Western-blotting結(jié)果表明micC基因缺失株在24℃過夜培養(yǎng)的條件下，外膜蛋白OmpD的表達(dá)量最高，而標(biāo)準(zhǔn)株及回補(bǔ)株

10、在相同條件培養(yǎng)下OmpD的表達(dá)量相對(duì)較低。LD50測定結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)株50336、缺失株50336△micC以及回補(bǔ)株50336△micC::micC對(duì)6周齡Balb/c小鼠的LD50分別為12.59cfu、5.01cfu、19.95cfu，說明sRNAmicC基因影響了腸炎沙門氏菌對(duì)Balb/c小鼠的毒力，缺失株50336△micC增強(qiáng)了腸炎沙門氏菌對(duì)Balb/c小鼠的毒力，而回補(bǔ)株50336△micC::micC則降低了腸炎沙門氏菌