水稻種子發(fā)育特異性表達鋅指基因的篩選及功能分析.pdf

1、鋅指蛋白基因是植物基因組中最大最復雜的基因家族之一，許多鋅指蛋白被推測為轉錄因子。研究表明它們在花發(fā)育、光形態(tài)建成、種子發(fā)育等植物特有的生物學過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，探討鋅指基因在水稻發(fā)育，特別是種子發(fā)育過程中的調控作用，將不僅有助于對水稻種子發(fā)育過程分子機制的了解，而且對改良水稻的產(chǎn)量和品質具有重要的實踐價值?！　”狙芯坷藐P鍵詞及網(wǎng)絡資源，在各種數(shù)據(jù)庫中搜索到了1300多條水稻鋅指蛋白基因序列

2、，通過比較分析，選擇其中354個未知功能的水稻鋅指基因序列設計引物。利用RT-PCR技術分析了這些鋅指基因在水稻不同器官及種子不同發(fā)育階段的表達特征，篩選出一批種子特異性、莖和／或葉、根特異性表達的鋅指基因及可能為組成型表達的鋅指基因，其中有10個鋅指基因在水稻種子發(fā)育過程特異性表達。這些結果為我們進一步洞察鋅指基因在種子發(fā)育過程中的作用創(chuàng)造了條件?！　≡趯?0個水稻種子發(fā)育特異性表達鋅指基因進行序列分析的基礎上，選擇了其中的3個(Z

3、F54、ZF77、ZF309)開展進一步研究。分別構建了鋅指基因ZF54、ZF77、ZF309上游啟動子區(qū)與GUS的融合表達載體pC54P-GUS、pC77P-GUS和0C309P-GUS及ZF54和ZF309的cDNA正義和反義表達載體pCU54S、pClJ54A、pCA309S和pCA309A；以期進一步了解它們的表達特征及其生物學功能。　　通過農(nóng)桿菌介異法，分別獲得了上述各載體的再生植株并種植于大田中。PCR檢測表明pC54P-

4、GUS，pC 77P-GUS,pC309P-GS,pCU54S和pCu54A等5個載體的重組片段均已整合進水稻基因組中。TO代GUS活性分析顯示：pC54P-GUS只在水稻種子中檢測到GUS表達，在根、莖、葉、穎花中均沒有檢測到GUS活性，顯示了種子發(fā)育特異性表達特征；pC77P-GUS的大多數(shù)轉基因植株在所有組織及發(fā)育階段均檢測到GUS活性，表現(xiàn)了與RT-PCR．不同的表達特征，其原因可能是克隆的ZF77上游啟動子片段的長度不足或克隆

5、序列本身的堿基錯誤所致，真實原因有待進一步構建載體分析。轉pC309P-GUS植株尚未抽穗，但在分蘗期的根、莖、葉中尚未檢測到GUS活性。轉基因陽性植株太少，對pCU54S、pCU54A轉基因TO植株的田間表型調查尚待這兩個載體新的轉基因植株再生。 鋅指基因家族是生物體內一個比較大的基因家族，推測總的鋅指基因數(shù)目可占各生物基因總數(shù)的2～4％。隨著水稻基因組序列的不斷闡釋，克隆和推定的水稻鋅指基因也在不斷增加。研究顯示，植物鋅指蛋

6、白在花發(fā)育、光形態(tài)建成、種子發(fā)育以及環(huán)境脅迫反應等過程中均具有至關重要的調節(jié)作用。水稻生產(chǎn)在我國國民經(jīng)濟中占有舉足輕重的地位，水稻種子發(fā)育是水稻生長和發(fā)育中變化最劇烈的生物學過程之一，其間涉及大量的基因的表達和調控。因此，探討鋅指基因在水稻種子發(fā)育過程中是否存在重要的調控作用，將不僅有助于對植物種子發(fā)育過程分子機制的了解，而且對改良水稻的產(chǎn)量和品質具有重要的實踐價值。 本研究基于已有和不斷增加的水稻基因組信息資源，通過關鍵詞和各

7、種數(shù)據(jù)庫收集到1300多條水稻鋅指蛋白基因序列，通過比較分析，選擇其中354個未知功能的水稻鋅指基因序列設計引物。利用RT-PCR技術分析了這些鋅指基因在水稻不同器官及種子不同發(fā)育階段的表達特征，篩選出一批種子特異性、莖、葉和／或根特異性表達的鋅指基因。在對10個種子特異性表達的鋅指基因進行基本的生物信息學分析的基礎上，選擇其中3個鋅指基因構建相關表達載體開展其功能分析。 其主要實驗內容及結果如下： l、354個水稻鋅指

8、基因的表達特征分析 利用Trizol法提取水稻根、莖、葉、花及不同發(fā)育時期種子的總RNA，RT-PCR分析了354個鋅指基因在不同組織(器官)及種子不同發(fā)育階段的表達特征。結果發(fā)現(xiàn)：354個鋅指基因中有138個鋅指基因引物能夠在水稻根、莖、葉、花、種子中的一個或幾個或所有器官中擴增出與預計大小相同的RT-PCR片段，初步篩選出一些器官或種子不同發(fā)育階段特異性表達的鋅指基因。如10個鋅指基因在水稻種子發(fā)育中、3個在葉中、2個在根

9、中、1個在莖中特異性表達，有8個鋅指基因傾向在花和種子中、5個在葉和種子中、2個在莖和種子中表達等，另有大量的鋅指基因傾向在三個或所有檢測器官中表達。水稻鋅指基因的這些表達特征暗示了鋅指基因可能參與了水稻生長發(fā)育的許多重要生物學過程的調控。 2、水稻種子特異性表達鋅指基因的克隆及表達載體構建 對10個水稻種子特異表達鋅指基因進行基本的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)：它們均推測為轉錄因子。其中有6個為CCCH型鋅指蛋白，2個C2H2型

10、鋅指蛋白，1個DHHC型和1個未分類型鋅指蛋白，表明CCCH型鋅指基因在種子發(fā)育過程可能有很重要的調控作用。 為了深入地了解水稻種子發(fā)育特異表達鋅指基因的生物學功能，我們選擇了3個CCCH型鋅指基因(ZF54、ZF77、ZF309)進行進一步遺傳分析。分別構建了鋅指基因ZF54、ZF77、ZF309上游啟動子區(qū)與GUS的融合表達載體(pC54P-GUS，pC77P-GUS和pC309P-GUS)及ZF54和ZF309的cDNA正

11、義和反義表達載體(pCU54S,pCU54A,pCA309S和pCA309A)：以期進一步了解它們的表達特征及其生物學功能。 3、轉基因植株的獲得及其分子檢測 將構建好的7個載體，用農(nóng)桿菌介導法轉化日本晴水稻成熟胚誘導的愈傷組織。目前，除pCA309S和pCA309A的轉化材料正在分化中，其余5個表達載體均已獲得轉基因再生植株。根據(jù)潮霉素選擇標記基因hpt引物，用PCR分別對5個表達載體的再生植株進行分子檢測。結果發(fā)現(xiàn)p

12、C54P-GUS，pC77P-GUS和pC309P-GUS分別獲得陽性克隆數(shù)為：4個、12個和22個，可用于GUS表達活性分析；而pCU54S和pCU54A的陽性克隆數(shù)分別僅1個和2個，對這兩個質粒需進行新的遺傳轉化，目前已獲得新的抗性愈傷組織正在分化中。 4、轉基因植株GUS活性檢測 利用組織化學染色法我們分別對pC54P-GUS，pC77P-GUS和pC309P-GUS的陽性轉基因植株進行GUS活性分析，取花、根、莖

13、、葉、種子(前、中、后期)進行GUS(β-葡萄糖苷酸酶)的組織化學染色。結果顯示：pC54P-GUS的4株陽性轉基因TO植株只在種子檢測GUS表達，在根、莖、葉、穎花中均沒有檢測到GUS活性。該結果與我們用RT-PCR分析的ZF54基因的表達特征一致，暗示了ZF54蛋白可能為水稻種子發(fā)育特異性調節(jié)因子。 pC77P-GUS的12個陽性克隆中，在大多數(shù)克隆(8個)的根、莖、葉、花及種子中均能檢測到GUS活性，與RT-PCR檢測結果