水稻種子發(fā)育特異性表達(dá)鋅指基因的篩選及功能分析.pdf

1、鋅指蛋白基因是植物基因組中最大最復(fù)雜的基因家族之一，許多鋅指蛋白被推測(cè)為轉(zhuǎn)錄因子。研究表明它們?cè)诨òl(fā)育、光形態(tài)建成、種子發(fā)育等植物特有的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。水稻是世界上最重要的糧食作物之一，探討鋅指基因在水稻發(fā)育，特別是種子發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用，將不僅有助于對(duì)水稻種子發(fā)育過(guò)程分子機(jī)制的了解，而且對(duì)改良水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的實(shí)踐價(jià)值?！　”狙芯坷藐P(guān)鍵詞及網(wǎng)絡(luò)資源，在各種數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到了1300多條水稻鋅指蛋白基因序列

2、，通過(guò)比較分析，選擇其中354個(gè)未知功能的水稻鋅指基因序列設(shè)計(jì)引物。利用RT-PCR技術(shù)分析了這些鋅指基因在水稻不同器官及種子不同發(fā)育階段的表達(dá)特征，篩選出一批種子特異性、莖和／或葉、根特異性表達(dá)的鋅指基因及可能為組成型表達(dá)的鋅指基因，其中有10個(gè)鋅指基因在水稻種子發(fā)育過(guò)程特異性表達(dá)。這些結(jié)果為我們進(jìn)一步洞察鋅指基因在種子發(fā)育過(guò)程中的作用創(chuàng)造了條件?！　≡趯?duì)10個(gè)水稻種子發(fā)育特異性表達(dá)鋅指基因進(jìn)行序列分析的基礎(chǔ)上，選擇了其中的3個(gè)(Z

3、F54、ZF77、ZF309)開(kāi)展進(jìn)一步研究。分別構(gòu)建了鋅指基因ZF54、ZF77、ZF309上游啟動(dòng)子區(qū)與GUS的融合表達(dá)載體pC54P-GUS、pC77P-GUS和0C309P-GUS及ZF54和ZF309的cDNA正義和反義表達(dá)載體pCU54S、pClJ54A、pCA309S和pCA309A；以期進(jìn)一步了解它們的表達(dá)特征及其生物學(xué)功能。　　通過(guò)農(nóng)桿菌介異法，分別獲得了上述各載體的再生植株并種植于大田中。PCR檢測(cè)表明pC54P-

4、GUS，pC 77P-GUS,pC309P-GS,pCU54S和pCu54A等5個(gè)載體的重組片段均已整合進(jìn)水稻基因組中。TO代GUS活性分析顯示：pC54P-GUS只在水稻種子中檢測(cè)到GUS表達(dá)，在根、莖、葉、穎花中均沒(méi)有檢測(cè)到GUS活性，顯示了種子發(fā)育特異性表達(dá)特征；pC77P-GUS的大多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株在所有組織及發(fā)育階段均檢測(cè)到GUS活性，表現(xiàn)了與RT-PCR．不同的表達(dá)特征，其原因可能是克隆的ZF77上游啟動(dòng)子片段的長(zhǎng)度不足或克隆

5、序列本身的堿基錯(cuò)誤所致，真實(shí)原因有待進(jìn)一步構(gòu)建載體分析。轉(zhuǎn)pC309P-GUS植株尚未抽穗，但在分蘗期的根、莖、葉中尚未檢測(cè)到GUS活性。轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株太少，對(duì)pCU54S、pCU54A轉(zhuǎn)基因TO植株的田間表型調(diào)查尚待這兩個(gè)載體新的轉(zhuǎn)基因植株再生。 鋅指基因家族是生物體內(nèi)一個(gè)比較大的基因家族，推測(cè)總的鋅指基因數(shù)目可占各生物基因總數(shù)的2～4％。隨著水稻基因組序列的不斷闡釋，克隆和推定的水稻鋅指基因也在不斷增加。研究顯示，植物鋅指蛋

6、白在花發(fā)育、光形態(tài)建成、種子發(fā)育以及環(huán)境脅迫反應(yīng)等過(guò)程中均具有至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。水稻生產(chǎn)在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位，水稻種子發(fā)育是水稻生長(zhǎng)和發(fā)育中變化最劇烈的生物學(xué)過(guò)程之一，其間涉及大量的基因的表達(dá)和調(diào)控。因此，探討鋅指基因在水稻種子發(fā)育過(guò)程中是否存在重要的調(diào)控作用，將不僅有助于對(duì)植物種子發(fā)育過(guò)程分子機(jī)制的了解，而且對(duì)改良水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的實(shí)踐價(jià)值。 本研究基于已有和不斷增加的水稻基因組信息資源，通過(guò)關(guān)鍵詞和各

7、種數(shù)據(jù)庫(kù)收集到1300多條水稻鋅指蛋白基因序列，通過(guò)比較分析，選擇其中354個(gè)未知功能的水稻鋅指基因序列設(shè)計(jì)引物。利用RT-PCR技術(shù)分析了這些鋅指基因在水稻不同器官及種子不同發(fā)育階段的表達(dá)特征，篩選出一批種子特異性、莖、葉和／或根特異性表達(dá)的鋅指基因。在對(duì)10個(gè)種子特異性表達(dá)的鋅指基因進(jìn)行基本的生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，選擇其中3個(gè)鋅指基因構(gòu)建相關(guān)表達(dá)載體開(kāi)展其功能分析。 其主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及結(jié)果如下： l、354個(gè)水稻鋅指

8、基因的表達(dá)特征分析 利用Trizol法提取水稻根、莖、葉、花及不同發(fā)育時(shí)期種子的總RNA，RT-PCR分析了354個(gè)鋅指基因在不同組織(器官)及種子不同發(fā)育階段的表達(dá)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：354個(gè)鋅指基因中有138個(gè)鋅指基因引物能夠在水稻根、莖、葉、花、種子中的一個(gè)或幾個(gè)或所有器官中擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)大小相同的RT-PCR片段，初步篩選出一些器官或種子不同發(fā)育階段特異性表達(dá)的鋅指基因。如10個(gè)鋅指基因在水稻種子發(fā)育中、3個(gè)在葉中、2個(gè)在根

9、中、1個(gè)在莖中特異性表達(dá)，有8個(gè)鋅指基因傾向在花和種子中、5個(gè)在葉和種子中、2個(gè)在莖和種子中表達(dá)等，另有大量的鋅指基因傾向在三個(gè)或所有檢測(cè)器官中表達(dá)。水稻鋅指基因的這些表達(dá)特征暗示了鋅指基因可能參與了水稻生長(zhǎng)發(fā)育的許多重要生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。 2、水稻種子特異性表達(dá)鋅指基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建 對(duì)10個(gè)水稻種子特異表達(dá)鋅指基因進(jìn)行基本的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：它們均推測(cè)為轉(zhuǎn)錄因子。其中有6個(gè)為CCCH型鋅指蛋白，2個(gè)C2H2型

10、鋅指蛋白，1個(gè)DHHC型和1個(gè)未分類型鋅指蛋白，表明CCCH型鋅指基因在種子發(fā)育過(guò)程可能有很重要的調(diào)控作用。 為了深入地了解水稻種子發(fā)育特異表達(dá)鋅指基因的生物學(xué)功能，我們選擇了3個(gè)CCCH型鋅指基因(ZF54、ZF77、ZF309)進(jìn)行進(jìn)一步遺傳分析。分別構(gòu)建了鋅指基因ZF54、ZF77、ZF309上游啟動(dòng)子區(qū)與GUS的融合表達(dá)載體(pC54P-GUS，pC77P-GUS和pC309P-GUS)及ZF54和ZF309的cDNA正

11、義和反義表達(dá)載體(pCU54S,pCU54A,pCA309S和pCA309A)：以期進(jìn)一步了解它們的表達(dá)特征及其生物學(xué)功能。 3、轉(zhuǎn)基因植株的獲得及其分子檢測(cè) 將構(gòu)建好的7個(gè)載體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化日本晴水稻成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織。目前，除pCA309S和pCA309A的轉(zhuǎn)化材料正在分化中，其余5個(gè)表達(dá)載體均已獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。根據(jù)潮霉素選擇標(biāo)記基因hpt引物，用PCR分別對(duì)5個(gè)表達(dá)載體的再生植株進(jìn)行分子檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)p

12、C54P-GUS，pC77P-GUS和pC309P-GUS分別獲得陽(yáng)性克隆數(shù)為：4個(gè)、12個(gè)和22個(gè)，可用于GUS表達(dá)活性分析；而pCU54S和pCU54A的陽(yáng)性克隆數(shù)分別僅1個(gè)和2個(gè)，對(duì)這兩個(gè)質(zhì)粒需進(jìn)行新的遺傳轉(zhuǎn)化，目前已獲得新的抗性愈傷組織正在分化中。 4、轉(zhuǎn)基因植株GUS活性檢測(cè) 利用組織化學(xué)染色法我們分別對(duì)pC54P-GUS，pC77P-GUS和pC309P-GUS的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS活性分析，取花、根、莖

13、、葉、種子(前、中、后期)進(jìn)行GUS(β-葡萄糖苷酸酶)的組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示：pC54P-GUS的4株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因TO植株只在種子檢測(cè)GUS表達(dá)，在根、莖、葉、穎花中均沒(méi)有檢測(cè)到GUS活性。該結(jié)果與我們用RT-PCR分析的ZF54基因的表達(dá)特征一致，暗示了ZF54蛋白可能為水稻種子發(fā)育特異性調(diào)節(jié)因子。 pC77P-GUS的12個(gè)陽(yáng)性克隆中，在大多數(shù)克隆(8個(gè))的根、莖、葉、花及種子中均能檢測(cè)到GUS活性，與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果