羊布魯氏菌Omp25、VjbR與小鼠巨噬細(xì)胞互作蛋白的篩選鑒定.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis,簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌引起的一種世界性人獸共患傳染病。目前,人畜布病主要集中在發(fā)展中國(guó)家,2000年以后,我國(guó)人畜布病有逐年上升的趨勢(shì),給畜牧業(yè)和人的健康造成了巨大危害。布病難以防控的原因是多方面的,其致病機(jī)制、胞內(nèi)寄生機(jī)制不清楚是主要原因。布魯氏菌能夠感染專職巨噬細(xì)胞和非專職巨噬細(xì)胞,并能在其中生存復(fù)制,其中巨噬細(xì)胞是布魯氏菌的主要感染對(duì)象。布魯氏菌之所以能在巨噬細(xì)胞內(nèi)寄生,推測(cè)是細(xì)菌蛋白與宿主細(xì)胞

2、蛋白相互作用的結(jié)果。當(dāng)前,布魯氏菌蛋白和巨噬細(xì)胞蛋白相互作用的機(jī)制還不清楚。
　　Omp25屬于布魯氏菌第3組外膜蛋白Omp25/Omp31家族中的一員,研究發(fā)現(xiàn)缺失Omp25基因的羊布魯氏菌突變株不會(huì)引起宿主流產(chǎn),且能夠在宿主體內(nèi)增殖,與其親本株相比毒力減弱且激發(fā)體液免疫的能力也減弱,說明Omp25既是毒力因子又是免疫原性蛋白。VjbR是密度感應(yīng)系統(tǒng)(Qurumsensing,QS)LuxR蛋白家族的一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子,能夠影響I

3、V型分泌系統(tǒng)(T4SS)和鞭毛基因表達(dá),并且它在布魯氏菌毒力和胞內(nèi)寄生中都發(fā)揮了重要作用。鑒于此,本研究構(gòu)建了羊布魯氏菌16M株感染小鼠巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù),并以O(shè)mp25、VjbR為誘餌蛋白從該文庫(kù)中篩選鑒定互作蛋白,為進(jìn)一步研究布魯氏菌的分子致病機(jī)制和胞內(nèi)寄生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　首先,利用分子克隆技術(shù)對(duì)羊布魯氏菌16M株Omp25、VjbR進(jìn)行克隆、測(cè)序,將其連接到pSos載體上,構(gòu)建誘餌載體,并檢測(cè)誘餌載體毒性、自激活性以及

4、膜定位。
　　其次,建立羊布魯氏菌16M株感染小鼠巨噬細(xì)胞模型,提取總RNA,分離、提純mRNA,構(gòu)建羊布魯氏菌16M株感染后的小鼠巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù),將文庫(kù)連接到pMyr獵物載體上。
　　然后,將誘餌質(zhì)粒和pMyr-cDNA文庫(kù)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化cdc25Hα酵母感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行互作蛋白篩選,并應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　通過以上實(shí)驗(yàn)研究,得到如下結(jié)果:
　　1、經(jīng)過測(cè)序表明羊布魯氏菌16M株Omp25、VjbR

5、基因克隆正確,并且成功連接到pSos載體上,構(gòu)建的誘餌載體對(duì)酵母細(xì)胞無毒副作用,無自激活性,膜上定位正確,能夠用于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。
　　2、利用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)和透射電鏡觀察,確立細(xì)菌和細(xì)胞按照500︰1的比例進(jìn)行感染,在感染4小時(shí)后可以成功建立羊布魯氏菌16M株感染小鼠巨噬細(xì)胞模型。
　　3、成功構(gòu)建了羊布魯氏菌16M株感染后小鼠巨噬細(xì)胞cDNA文庫(kù),并將文庫(kù)與獵物載體pMyr相連,構(gòu)建了pMyr-cDNA質(zhì)粒文庫(kù)。質(zhì)粒庫(kù)

6、容為1.6×109cfu/mL,重組率較高。
　　4、將誘餌質(zhì)粒和pMyr-cDNA文庫(kù)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化cdc25Hα酵母感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行酵母雙雜交,結(jié)果篩選到2個(gè)陽性克隆,經(jīng)測(cè)序兩個(gè)基因分別為NDAH還原酶裝備因子2(Mus musculus NADH dehydrogenase(ubiquinone)1 alpha subcomplex,assembly factor 2(NM_001127346.1),Ndufaf2)和核糖體蛋白S

7、5(Mus musculus ribosomal protein S5(NM_009095.2),RPS5)。經(jīng)免疫共沉淀驗(yàn)證Ndufaf2能夠與Omp25發(fā)生相互作用,RPSs5能夠與VjbR發(fā)生相互作用。通過上述試驗(yàn)結(jié)果,我們提出如下假設(shè):(1)Omp25和Ndufaf2結(jié)合后,可以促進(jìn)細(xì)胞中NADH濃度增加,提高NADH活性,降低巨噬細(xì)胞對(duì)布魯氏菌的氧化殺傷,從而創(chuàng)造了有利于布魯氏菌胞內(nèi)生存的條件。(2)VjbR與RPS5結(jié)合后,