延邊牛布魯氏菌的分離及bp26基因的克隆和原核表達(dá).pdf

1、布魯氏菌?。╞rucellosis）是人類(lèi)與畜禽以及野生動(dòng)物之間自然傳播的人獸共患傳染病，但是人與人之間幾乎不傳染。布魯氏菌病在家畜中牛，羊，豬感染的情況較多，可通過(guò)飲用水及分泌物傳染給人類(lèi)和其他家畜?；疾〖倚髸?huì)引起生殖器官和胎膜發(fā)炎，導(dǎo)致流產(chǎn)、不育和各種組織的局部病灶等臨床癥狀。隨著布魯氏菌病在世界各地蔓延，已經(jīng)有超過(guò)100個(gè)國(guó)家報(bào)道了該病的流行，尤其是在貧窮落后的發(fā)展中國(guó)家，由于對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的重視程度較低以及養(yǎng)殖技術(shù)落后，布魯氏菌發(fā)病情

2、況更為嚴(yán)重。近幾年來(lái)，布魯氏菌病在延邊州的流行區(qū)域逐漸擴(kuò)大，發(fā)病率和感染率不斷上升，已成為嚴(yán)重威脅延邊黃牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要疫病之一，因此，分離布魯氏菌本地株、建立檢測(cè)方法以及疫苗的研究是十分必要的。
　　為了分離鑒定布魯氏菌延邊株，以及預(yù)防布魯氏菌在該區(qū)的流行，本試驗(yàn)利用牛流產(chǎn)的胎衣分離出一株布魯氏菌，并應(yīng)用布魯氏菌選擇性培養(yǎng)基、H2O2試驗(yàn)、尿素酶氧化試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)等生化鑒定，以及進(jìn)行姬姆薩染色和柯茲洛夫斯基染色鏡檢以及 AMO

3、S-PCR診斷試劑盒進(jìn)行了初步鑒定。結(jié)果顯示，在改進(jìn)的布魯氏菌選擇性培養(yǎng)基上分離出了特異的菌落；H2O2試驗(yàn)有氣泡產(chǎn)生，尿素酶氧化試驗(yàn)培養(yǎng)基顏色由黃色變?yōu)樽仙?，生化鑒定結(jié)果為陽(yáng)性，姬姆薩染色和柯茲洛夫斯基染色鏡檢可見(jiàn)清晰的球桿形菌體，AMOS-PCR顯示有180 bp和880 bp兩條清晰帶，以上結(jié)果初步證明所分離的菌體為布魯氏菌。
　　根據(jù) GenBank中的發(fā)表的布魯氏菌 bp26基因,設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性引物,以提取的分離株布

4、魯氏菌的總 DNA為模板 PCR擴(kuò)增得到了 bp26基因,克隆到pMD18-T載體上，亞克隆到 pGEX-4T-1原核表達(dá)載體上，構(gòu)建 pGEX-4T-bp26重組表達(dá)載體，將 PCR和酶切鑒定正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出試驗(yàn)所預(yù)期大小的融合蛋白。SDS-PAGE分析和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，表達(dá)的蛋白大小約為53 KDa，該蛋白具有較好的反應(yīng)原性。本試驗(yàn)為進(jìn)一步以該蛋白為抗