布魯氏菌Omp25對(duì)胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞炎性機(jī)制初步研究.pdf

1、目的：布魯氏菌?。╞rucellosis）(以下簡(jiǎn)稱布病)是由布魯氏菌引起的人、畜共患傳染病，廣泛分布于世界各地。布病對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)建設(shè)、人民健康生活、國(guó)家安全等存在著嚴(yán)重的威脅。布病的病原為布魯氏菌，是一種胞內(nèi)寄生菌,它的致病機(jī)制以胞內(nèi)生存為主要特征。胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞是布魯氏菌感染的靶細(xì)胞，一旦被破壞，容易引起流產(chǎn)，但是其分子機(jī)制目前還不清楚。布魯氏菌外膜蛋白和Ⅳ型分泌系統(tǒng)家族蛋白與布魯氏菌的侵染、胞內(nèi)生存、繁殖有直接關(guān)系，是公認(rèn)的毒力因子

2、。通過探討毒力因子對(duì)感染靶細(xì)胞的作用成為研究布魯氏菌致病機(jī)制的分子基礎(chǔ)，為探索布病藥物作用的候選靶點(diǎn)奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法：（1）以pET32a為載體，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a-omp25，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌中得到了表達(dá)43.5 KD Omp25融合蛋白，并成功分離純化蛋白。（2）以真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP為載體，將omp25基因克隆至EGFP基因上游，構(gòu)建表達(dá)Omp25-EGFP融合蛋白的真核表達(dá)載體pEGFP-

3、omp25；（3）根據(jù)omp25核苷酸序列，分別構(gòu)建siRNA -a/b/c三個(gè)干擾載體，應(yīng)用脂質(zhì)體，將pEGFP-omp25分別與siRNAs共轉(zhuǎn)染HPT-8細(xì)胞，實(shí)時(shí)定量PCR篩選最優(yōu)干擾質(zhì)粒。（4）以 Omp25蛋白的毒力效應(yīng)及其作用機(jī)制為切入點(diǎn)，分別以正相（已純化Omp25蛋白刺激）和反向（RNAi）分析方法，對(duì)Omp25蛋白誘發(fā)人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞HPT-8引發(fā)的炎性信號(hào)分子表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。
　　 結(jié)果：（1）成功構(gòu)建高效

4、表達(dá)載體pET32a-omp25，并分離純化蛋白；（2）成功構(gòu)建表達(dá)pEGFP-omp25真核質(zhì)粒和構(gòu)建針對(duì)omp25三個(gè)干擾載體，實(shí)時(shí)定量篩選出了優(yōu)秀干擾片段，抑制率可達(dá)到98%；（3）ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：NO,LDH活力及上清中炎性相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α隨Omp25蛋白濃度呈不同程度的上升；（4）實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示Omp25蛋白使得TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)量上調(diào)。
　　 結(jié)論：（1）低劑量的Omp25