雞白細(xì)胞介素6單克隆抗體的研制與鑒定.pdf

1、雞白細(xì)胞介素-6(chIL-6)是一種在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中具有多種功能的細(xì)胞因子，是免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。目前，chIL-6的生物學(xué)檢測(cè)主要依賴于淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)或細(xì)胞因子依賴性細(xì)胞增殖試驗(yàn)，然而，這些試驗(yàn)費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、敏感性低，而且受很多因素如培養(yǎng)物、抑制因子以及其它生長因子的影響。因此，迫切需要一種簡(jiǎn)單、快速、敏感的chIL-6檢測(cè)方法。本研究采用chIL-6真核表達(dá)質(zhì)粒作為免疫原，原核表達(dá)產(chǎn)物作為篩選抗原，研制出抗chIL-6的單克隆抗

2、體，為建立一種快捷檢測(cè)chIL-6的方法奠定基礎(chǔ)。
　　 將含chIL-6基因的質(zhì)粒(云水麗構(gòu)建)克隆至真核高效表達(dá)載體pcDNA3.1(-)中，構(gòu)建pcDNA-IL-6重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，收集細(xì)胞上清，利用白介素-6生長依賴細(xì)胞株7TD1檢測(cè)，結(jié)果表明細(xì)胞上清可促進(jìn)7TD1細(xì)胞的生長，證明pcDNA-IL-6在COS-1細(xì)胞中能產(chǎn)生具有生物活性的chIL-6。

3、r>　　 將chIL-6 cDNA分段克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-IL6-1和pET-IL6-2，重組質(zhì)?？稍诖竽c桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)表明，兩種表達(dá)蛋白以上清的形式存在。以鼠抗chIL-6多抗血清進(jìn)行Western-blot試驗(yàn)，證明兩種蛋白均具有良好的抗原性。將誘導(dǎo)后的工程菌超聲波裂解，離心后取上清，采用帶HIS標(biāo)簽的蛋白純化柱子純化，獲得了濃度分別為1.8

4、mg/mL和1.0mg/m L的純化蛋白。
　　 以重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-IL-6作為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，每只每次肌肉注射100μg，每隔2星期免疫1次，免疫5次后，取小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞SP2/0-AG-14進(jìn)行融合。以chIL-6原核表達(dá)純化蛋白作為篩選的抗原，通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)對(duì)雜交瘤進(jìn)行篩選。經(jīng)亞克隆后共獲得3株雞IL-6特異性單抗，分別命名為11E8、15B6和18H9，11

5、E8、15B6兩株單抗均屬于lgG亞類，18H9單抗屬于IgM亞類；腹水的間接ELISA效價(jià)分別為：10×214、10×215和10×211。三株單抗以間接免疫熒光法檢測(cè)pcDNA-IL-6轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞，均產(chǎn)生特異性綠色熒光，其中15B6熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。
　　 本研究成功構(gòu)建了表達(dá)chIL-6的真核重組質(zhì)粒和原核重組質(zhì)粒，并采用真核表達(dá)質(zhì)粒免疫，原核表達(dá)產(chǎn)物篩選的方式獲得了3株針對(duì)chIL-6的單抗，為進(jìn)一步研究chIL-6