雞白細胞介素6單克隆抗體的研制與鑒定.pdf

1、雞白細胞介素-6(chIL-6)是一種在機體免疫調(diào)節(jié)中具有多種功能的細胞因子，是免疫學研究的熱點之一。目前，chIL-6的生物學檢測主要依賴于淋巴細胞增殖試驗或細胞因子依賴性細胞增殖試驗，然而，這些試驗費時、費力、敏感性低，而且受很多因素如培養(yǎng)物、抑制因子以及其它生長因子的影響。因此，迫切需要一種簡單、快速、敏感的chIL-6檢測方法。本研究采用chIL-6真核表達質(zhì)粒作為免疫原，原核表達產(chǎn)物作為篩選抗原，研制出抗chIL-6的單克隆抗

2、體，為建立一種快捷檢測chIL-6的方法奠定基礎。
　　 將含chIL-6基因的質(zhì)粒(云水麗構(gòu)建)克隆至真核高效表達載體pcDNA3.1(-)中，構(gòu)建pcDNA-IL-6重組表達質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-1細胞，收集細胞上清，利用白介素-6生長依賴細胞株7TD1檢測，結(jié)果表明細胞上清可促進7TD1細胞的生長，證明pcDNA-IL-6在COS-1細胞中能產(chǎn)生具有生物活性的chIL-6。

3、r>　　 將chIL-6 cDNA分段克隆到原核表達載體pET-32a(+)中，構(gòu)建原核重組表達質(zhì)粒pET-IL6-1和pET-IL6-2，重組質(zhì)粒可在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達，SDS-PAGE檢測表明，兩種表達蛋白以上清的形式存在。以鼠抗chIL-6多抗血清進行Western-blot試驗，證明兩種蛋白均具有良好的抗原性。將誘導后的工程菌超聲波裂解，離心后取上清，采用帶HIS標簽的蛋白純化柱子純化，獲得了濃度分別為1.8

4、mg/mL和1.0mg/m L的純化蛋白。
　　 以重組表達質(zhì)粒pcDNA-IL-6作為免疫原，免疫8周齡的BALB/c小鼠，每只每次肌肉注射100μg，每隔2星期免疫1次，免疫5次后，取小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞SP2/0-AG-14進行融合。以chIL-6原核表達純化蛋白作為篩選的抗原，通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)對雜交瘤進行篩選。經(jīng)亞克隆后共獲得3株雞IL-6特異性單抗，分別命名為11E8、15B6和18H9，11

5、E8、15B6兩株單抗均屬于lgG亞類，18H9單抗屬于IgM亞類；腹水的間接ELISA效價分別為：10×214、10×215和10×211。三株單抗以間接免疫熒光法檢測pcDNA-IL-6轉(zhuǎn)染COS-1細胞，均產(chǎn)生特異性綠色熒光，其中15B6熒光強度最強。
　　 本研究成功構(gòu)建了表達chIL-6的真核重組質(zhì)粒和原核重組質(zhì)粒，并采用真核表達質(zhì)粒免疫，原核表達產(chǎn)物篩選的方式獲得了3株針對chIL-6的單抗，為進一步研究chIL-6