抗雞白細(xì)胞介素4的表達(dá)及其產(chǎn)物單克隆抗體的制備與初步鑒定.pdf

1、白細(xì)胞介素4(IL-4)主要由Th2型細(xì)胞分泌，對(duì)Th2細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄及抗凋亡起著十分重要的作用，具有多種免疫學(xué)調(diào)節(jié)功能，可與多種類型細(xì)胞相互作用從而調(diào)節(jié)宿主的防御能力及免疫應(yīng)答，是機(jī)體體液免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子。已有大量文獻(xiàn)對(duì)哺乳類動(dòng)物IL-4的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究，但在家禽中，因缺乏特異性試劑而影響了對(duì)禽類IL-4的研究，本研究旨在制備抗雞IL-4特異性單克隆抗體(McAbs)，從而為家禽的免疫檢測(cè)、免疫細(xì)胞功能分析和免疫調(diào)節(jié)等

2、方面的研究提供生物材料。
　　一.免疫原與檢測(cè)抗原的制備
　　核酸免疫原的制備:將重組菌DH5α(pVAX1-preChIL-4)大量擴(kuò)增培養(yǎng)后，經(jīng)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法大量提取質(zhì)粒，獲得pVAX1-preChIL-4質(zhì)粒，濃度為15 mg/ml，純度(A260/A280)為1.81，作為核酸免疫原。
　　蛋白免疫原的制備:將原核表達(dá)重組菌BL21(DE3)(pET-ChIL-4)大量擴(kuò)增培養(yǎng)后，經(jīng)IPTG

3、誘導(dǎo)表達(dá)，Ni柱親和層析純化，獲得His-ChIL-4重組蛋白。BrdU-ELISA實(shí)驗(yàn)表明，His-ChIL4具有促進(jìn)雞B細(xì)胞增殖的活性，且蛋白濃度為40μg/ml時(shí)活性最強(qiáng)。
　　檢測(cè)抗原的制備:將原核表達(dá)重組表達(dá)菌BL21(pGEX-ChIL-4)大量擴(kuò)增培養(yǎng)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，親和層析純化，獲得GST-ChIL-4重組蛋白，作為檢測(cè)抗原。
　　二.抗雞白細(xì)胞介素4單克隆抗體的制備與鑒定
　　采用核酸免疫法、

4、蛋白免疫法兩種途徑分別制備抗ChIL-4單克隆抗體(McAbs)。核酸免疫法:以真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-preChIL-4為免疫原，免疫4周齡BALB/c小鼠，每隔4周免疫一次，共免疫4次，前三次免疫采用股四頭肌注射質(zhì)粒與麻醉劑的混合物，加強(qiáng)免疫采用尾靜脈注射純化質(zhì)粒，劑量均為100μg/只;蛋白免疫法:以重組蛋白His-ChIL-4為免疫原，免疫8周齡BALB/c小鼠，免疫途徑采用腹部皮下多點(diǎn)法，首次免疫注射蛋白與弗氏完全佐劑乳化液，

5、其余免疫注射蛋白與弗氏不完全佐劑乳化液，每隔2周免疫一次，共免疫3次，劑量均為100μg/只，三免2周后尾靜脈注射His-ChIL-4作為加強(qiáng)免疫，50μg/只。以GST-ChIL-4為檢測(cè)原，間接ELISA篩選陽(yáng)性克隆，有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，以獲得穩(wěn)定分泌抗ChIL-4 McAbs的雜交瘤細(xì)胞株。通過(guò)體內(nèi)誘生腹水法制備腹水McAbs，間接ELISA、Dot-ELISA和Western-Blot法對(duì)McAbs的特異性進(jìn)行測(cè)定，并應(yīng)用Br

6、dU-ELISA對(duì)McAbs抑制ChIL-4增殖活性的能力進(jìn)行測(cè)定。
　　本課題共獲得6株穩(wěn)定分泌抗ChIL-4的McAbs:3E10、4D9、5B11、5C1、5D9和5E12。間接ELISA顯示，6株McAbs細(xì)胞株的分泌上清效價(jià)分別為1∶800、1∶12800、1∶800、1∶800、1∶3200和1∶800;腹水效價(jià)分別為1∶1.28×104、1∶1.204×106、1∶1.28×105、1∶1.28×104、1∶2.56

7、×105、和1∶1.28×105;亞類分別為IgG2a、IgG1、IgG1、IgG1、IgM和IgG1。Dot-ELISA結(jié)果表明，6株McAbs均只與ChIL-4特異性結(jié)合，與其他幾種重組細(xì)胞因子:牛IL-4(BovIL-4)、雞IFN-γ（ChIFN-γ）、牛IFN-γ(BovIFN-γ)和梅花鹿IFN-γ(CerIFN-γ)均無(wú)交叉反應(yīng)。Western-Blot結(jié)果顯示，6株McAbs均只與ChIL-4特異性結(jié)合。McAbs抑制C