c-jun對仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌影響的機(jī)理研究.pdf

1、兩性配子的生成是動物繁衍的前提和基礎(chǔ),睪酮在精子生成過程中具有十分重要的作用。睪酮不僅在精子生成過程中具有十分重要的作用,而且睪酮還參與維持雄性動物的第二性征,對精子的活力、授精的成功率也有重要的影響。間質(zhì)細(xì)胞是雄性動物體內(nèi)產(chǎn)生睪酮最主要的細(xì)胞,研究間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成的調(diào)控機(jī)制對于深入認(rèn)識精子生成的分子機(jī)制,預(yù)防和治療雄性不育均有十分重要的意義。關(guān)于睪酮合成機(jī)制的研究以往多集中在下丘腦-垂體-睪丸軸內(nèi)分泌調(diào)節(jié)和促性腺激素對睪酮合成的影響上

2、,但近年來的研究表明,原癌基因的表達(dá)在睪酮合成中起著十分重要的作用。本研究以榮昌豬為實驗動物,利用體內(nèi)體外模型探討原癌基因c-jun對睪酮合成的調(diào)節(jié)機(jī)制,為進(jìn)一步認(rèn)識原癌基因在精子生成中的作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　 大量的研究表明,睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌也伴有某些原癌基因的表達(dá)變化,特別是即時早期基因的表達(dá)變化。這些即時早期基因主要包括fos成員和jun家族。我們以c-jun為目的基因,以1、3、5周齡的榮昌仔豬睪丸為研究對象,采

3、用實時熒光定量RT-PCR方法和放射免疫法研究了c-jun mRNA在仔豬睪丸中的表達(dá)及表達(dá)與血漿睪酮水平的關(guān)系,并切片觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)的變化。實驗結(jié)果表明:c-jun mRNA在1、3、5周齡仔豬睪丸組織中均有表達(dá)。其中3周齡表達(dá)較高,5周齡次之,1周齡較低,3周齡與5周齡和1周齡相比存在顯著差異(P<0.05)。血漿睪酮水平在第3周最高,在其他時期較低,3周齡與1周齡、5周齡比較差異顯著(P<0.01),3周齡仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐

4、漸完整,5周齡數(shù)量有所下降。c-jun mRNA的表達(dá)與血漿睪酮水平及間質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化可能存在一致性。3周齡榮昌仔豬睪丸作為研究睪酮分泌機(jī)制的材料是適宜的。
　　 通過不同時間仔豬睪丸組織c-jun mRNA表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),其表達(dá)水平與血漿睪酮濃度檢測結(jié)果有一致性。為了進(jìn)一步了解c-jun mRNA表達(dá)和睪酮分泌的關(guān)系,采用了體外培養(yǎng)的間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行研究,目的是排除其他細(xì)胞(如支持細(xì)胞、生精細(xì)胞)的干擾。通過錐蟲藍(lán)試驗和3β-HSD

5、酶活性檢測,用酶解法結(jié)合差速離心分離的榮昌仔豬間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較多,純度較高,其活力為(93.O±4.9)％,純化后的細(xì)胞百分率為(85.14±3.6)％。睪酮基礎(chǔ)分泌量隨培養(yǎng)的時間延長而增高,兩者呈線性關(guān)系(r=0.826,P<0.01),培養(yǎng)至4h后增長峰趨于平緩。隨著hCG刺激濃度的增加,睪酮分泌量增加,兩者呈明顯線性關(guān)系(r=0.893,P<0.01)。當(dāng)hCG濃度達(dá)到50IU/mL時,誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌量最高。本實驗中均采用

6、50IU/mL為hCG誘導(dǎo)濃度。為了進(jìn)一步準(zhǔn)確了解c-jun mRNA表達(dá)與睪酮分泌的關(guān)系,我們采用了反義核酸技術(shù),即將c-jun基因制備成反義c-junASODNs與體外培養(yǎng)的3周齡睪丸間質(zhì)細(xì)胞共育,了解c-jun表達(dá)與睪酮分泌的量效關(guān)系。同時,通過MTT和TUNEL法了解睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌過程中細(xì)胞增殖和凋亡的作用。結(jié)果顯示,c-juunASODNs以劑量依賴性方式抑制基礎(chǔ)狀態(tài)下睪酮分泌(P<0.01)及睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖(P＜0.

7、01),當(dāng)加入1μmol/L c-junASODNs時,顯著抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡(P<0.05)。這表明c-jun可促進(jìn)基礎(chǔ)狀態(tài)下仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌,這種作用與c-jun促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)。
　　 睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分泌有基礎(chǔ)性分泌和促性腺激素誘導(dǎo)的分泌,后者受下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)。絨毛膜促性腺激素hCG可與間質(zhì)細(xì)胞表面受體結(jié)合,使ATP(-)→cAMP,而cAMP可動員膽吲醇經(jīng)過一系列中間步驟,最終生成睪

8、酮。本試驗通過c-jun ASODNs誘導(dǎo)觀察c-jun在調(diào)節(jié)hCG誘導(dǎo)的仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的作用,采用c-junASODNs拮抗c-jun,維拉帕米阻斷鈣通道,添加cAMP觀察其對體外培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)hCG可刺激榮昌仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌,c-jun ASODNs(0.125-2μmol/L)呈劑量依賴性抑制hCG誘導(dǎo)離體睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分泌(P<0.01),加用cAMP后睪酮分泌增加,可逆轉(zhuǎn)c-junAS

9、ODNs抑制hCG誘導(dǎo)離體睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌。維拉帕米(10-5mol/L)可增加c-junASODNs抑制睪酮分泌作用。因此,推測c-jun在促進(jìn)hCG誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮過程中,主要通過以下信號途徑傳遞信息:
　　 (1)hCG作用于仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜特異性受體,通過G蛋白介導(dǎo),激活腺苷酸環(huán)化酶,從而使cAMP生成增多,然后以cAMP作為第二信使,通過cAMP-PKA途徑導(dǎo)致核內(nèi)原癌基因c-jun轉(zhuǎn)錄和翻譯,其表達(dá)產(chǎn)物間

10、或產(chǎn)物與c-fos蛋白在亮氨酸拉鏈區(qū)(leucnezipper)形成同源或異源二聚體復(fù)合物,與靶基因的AP-1(activator protein1)位點結(jié)合,直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性,激活一些晚期基因轉(zhuǎn)錄,如P450c17 mRNA,后經(jīng)過一系列酶作用,促進(jìn)睪酮的合成和分泌。
　　 (2)hCG作用于睪丸間質(zhì)細(xì)胞膜上特異性受體,使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高,然后以Ca2+作為第二信使,通過IP3-DAG.鈣調(diào)蛋白激酶途徑繼而使核內(nèi)原癌基因

11、c-jun轉(zhuǎn)錄激活。其表達(dá)產(chǎn)物間或產(chǎn)物與c-fos蛋白在亮氨酸拉鏈區(qū)形成同源或異源二聚體復(fù)合物,與靶基因的AP-1位點結(jié)合,直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性,激活一些晚期基因轉(zhuǎn)錄,如P450c17 mRNA,然后經(jīng)過一系列酶作用,促進(jìn)睪酮的合成和分泌。
　　 綜上所述,我們可以得到以下結(jié)論:
　　 1、c-iun mRNA在1、3、5周齡榮昌仔豬睪丸中均有表達(dá),3周齡較高,其變化趨勢與血漿中睪酮水平變化有一致性。
　　 2、酶解

12、法結(jié)合差速離心分離的榮昌仔豬間質(zhì)細(xì)胞活力強(qiáng),純度較高,數(shù)量較多。隨著培養(yǎng)時間延長,睪酮分泌量增加,4h達(dá)峰值。隨著hCG的濃度增加,睪酮分泌增加,50IU/mL的hCG刺激的睪酮分泌達(dá)峰值。
　　 3、c-jun能劑量依賴性促進(jìn)基礎(chǔ)狀態(tài)下的睪酮分泌,可能與促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)。
　　 4、c-jun能劑量依賴性影響hCG誘導(dǎo)的睪酮分泌。
　　 5、c-j強(qiáng)在調(diào)節(jié)hCG誘導(dǎo)睪酮的分泌過程中,可能的機(jī)制是通過h