c-jun對仔豬睪丸間質細胞睪酮分泌影響的機理研究.pdf

1、兩性配子的生成是動物繁衍的前提和基礎,睪酮在精子生成過程中具有十分重要的作用。睪酮不僅在精子生成過程中具有十分重要的作用,而且睪酮還參與維持雄性動物的第二性征,對精子的活力、授精的成功率也有重要的影響。間質細胞是雄性動物體內產生睪酮最主要的細胞,研究間質細胞睪酮合成的調控機制對于深入認識精子生成的分子機制,預防和治療雄性不育均有十分重要的意義。關于睪酮合成機制的研究以往多集中在下丘腦-垂體-睪丸軸內分泌調節(jié)和促性腺激素對睪酮合成的影響上

2、,但近年來的研究表明,原癌基因的表達在睪酮合成中起著十分重要的作用。本研究以榮昌豬為實驗動物,利用體內體外模型探討原癌基因c-jun對睪酮合成的調節(jié)機制,為進一步認識原癌基因在精子生成中的作用提供基礎數據。
　　 大量的研究表明,睪丸間質細胞的睪酮分泌也伴有某些原癌基因的表達變化,特別是即時早期基因的表達變化。這些即時早期基因主要包括fos成員和jun家族。我們以c-jun為目的基因,以1、3、5周齡的榮昌仔豬睪丸為研究對象,采

3、用實時熒光定量RT-PCR方法和放射免疫法研究了c-jun mRNA在仔豬睪丸中的表達及表達與血漿睪酮水平的關系,并切片觀察睪丸組織結構的變化。實驗結果表明:c-jun mRNA在1、3、5周齡仔豬睪丸組織中均有表達。其中3周齡表達較高,5周齡次之,1周齡較低,3周齡與5周齡和1周齡相比存在顯著差異(P<0.05)。血漿睪酮水平在第3周最高,在其他時期較低,3周齡與1周齡、5周齡比較差異顯著(P<0.01),3周齡仔豬睪丸間質細胞結構逐

4、漸完整,5周齡數量有所下降。c-jun mRNA的表達與血漿睪酮水平及間質細胞結構變化可能存在一致性。3周齡榮昌仔豬睪丸作為研究睪酮分泌機制的材料是適宜的。
　　 通過不同時間仔豬睪丸組織c-jun mRNA表達分析發(fā)現,其表達水平與血漿睪酮濃度檢測結果有一致性。為了進一步了解c-jun mRNA表達和睪酮分泌的關系,采用了體外培養(yǎng)的間質細胞進行研究,目的是排除其他細胞(如支持細胞、生精細胞)的干擾。通過錐蟲藍試驗和3β-HSD

5、酶活性檢測,用酶解法結合差速離心分離的榮昌仔豬間質細胞數量較多,純度較高,其活力為(93.O±4.9)％,純化后的細胞百分率為(85.14±3.6)％。睪酮基礎分泌量隨培養(yǎng)的時間延長而增高,兩者呈線性關系(r=0.826,P<0.01),培養(yǎng)至4h后增長峰趨于平緩。隨著hCG刺激濃度的增加,睪酮分泌量增加,兩者呈明顯線性關系(r=0.893,P<0.01)。當hCG濃度達到50IU/mL時,誘導睪丸間質細胞睪酮分泌量最高。本實驗中均采用

6、50IU/mL為hCG誘導濃度。為了進一步準確了解c-jun mRNA表達與睪酮分泌的關系,我們采用了反義核酸技術,即將c-jun基因制備成反義c-junASODNs與體外培養(yǎng)的3周齡睪丸間質細胞共育,了解c-jun表達與睪酮分泌的量效關系。同時,通過MTT和TUNEL法了解睪丸間質細胞睪酮分泌過程中細胞增殖和凋亡的作用。結果顯示,c-juunASODNs以劑量依賴性方式抑制基礎狀態(tài)下睪酮分泌(P<0.01)及睪丸間質細胞增殖(P＜0.

7、01),當加入1μmol/L c-junASODNs時,顯著抑制睪丸間質細胞的凋亡(P<0.05)。這表明c-jun可促進基礎狀態(tài)下仔豬睪丸間質細胞睪酮的分泌,這種作用與c-jun促進睪丸間質細胞增殖和凋亡有關。
　　 睪丸間質細胞的分泌有基礎性分泌和促性腺激素誘導的分泌,后者受下丘腦-垂體-性腺軸調節(jié)。絨毛膜促性腺激素hCG可與間質細胞表面受體結合,使ATP(-)→cAMP,而cAMP可動員膽吲醇經過一系列中間步驟,最終生成睪

8、酮。本試驗通過c-jun ASODNs誘導觀察c-jun在調節(jié)hCG誘導的仔豬睪丸間質細胞分泌的作用,采用c-junASODNs拮抗c-jun,維拉帕米阻斷鈣通道,添加cAMP觀察其對體外培養(yǎng)睪丸間質細胞睪酮分泌的影響。結果發(fā)現hCG可刺激榮昌仔豬睪丸間質細胞的睪酮分泌,c-jun ASODNs(0.125-2μmol/L)呈劑量依賴性抑制hCG誘導離體睪丸間質細胞的分泌(P<0.01),加用cAMP后睪酮分泌增加,可逆轉c-junAS

9、ODNs抑制hCG誘導離體睪丸間質細胞的睪酮分泌。維拉帕米(10-5mol/L)可增加c-junASODNs抑制睪酮分泌作用。因此,推測c-jun在促進hCG誘導間質細胞分泌睪酮過程中,主要通過以下信號途徑傳遞信息:
　　 (1)hCG作用于仔豬睪丸間質細胞膜特異性受體,通過G蛋白介導,激活腺苷酸環(huán)化酶,從而使cAMP生成增多,然后以cAMP作為第二信使,通過cAMP-PKA途徑導致核內原癌基因c-jun轉錄和翻譯,其表達產物間

10、或產物與c-fos蛋白在亮氨酸拉鏈區(qū)(leucnezipper)形成同源或異源二聚體復合物,與靶基因的AP-1(activator protein1)位點結合,直接調節(jié)轉錄活性,激活一些晚期基因轉錄,如P450c17 mRNA,后經過一系列酶作用,促進睪酮的合成和分泌。
　　 (2)hCG作用于睪丸間質細胞膜上特異性受體,使細胞內Ca2+濃度增高,然后以Ca2+作為第二信使,通過IP3-DAG.鈣調蛋白激酶途徑繼而使核內原癌基因

11、c-jun轉錄激活。其表達產物間或產物與c-fos蛋白在亮氨酸拉鏈區(qū)形成同源或異源二聚體復合物,與靶基因的AP-1位點結合,直接調節(jié)轉錄活性,激活一些晚期基因轉錄,如P450c17 mRNA,然后經過一系列酶作用,促進睪酮的合成和分泌。
　　 綜上所述,我們可以得到以下結論:
　　 1、c-iun mRNA在1、3、5周齡榮昌仔豬睪丸中均有表達,3周齡較高,其變化趨勢與血漿中睪酮水平變化有一致性。
　　 2、酶解

12、法結合差速離心分離的榮昌仔豬間質細胞活力強,純度較高,數量較多。隨著培養(yǎng)時間延長,睪酮分泌量增加,4h達峰值。隨著hCG的濃度增加,睪酮分泌增加,50IU/mL的hCG刺激的睪酮分泌達峰值。
　　 3、c-jun能劑量依賴性促進基礎狀態(tài)下的睪酮分泌,可能與促進間質細胞增殖和凋亡有關。
　　 4、c-jun能劑量依賴性影響hCG誘導的睪酮分泌。
　　 5、c-j強在調節(jié)hCG誘導睪酮的分泌過程中,可能的機制是通過h