c-Jun靶基因及其對(duì)神經(jīng)元凋亡的調(diào)控.pdf

1、神經(jīng)元凋亡是由一系列基因控制的主動(dòng)過程，轉(zhuǎn)錄抑制劑actinomycin D及蛋白合成抑制劑cycloheximide可以有效地保護(hù)神經(jīng)元，說明凋亡的發(fā)生需要新的RNA的轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)的合成。從關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路入手，系統(tǒng)地尋找凋亡過程中的關(guān)鍵分子，并探索其調(diào)控機(jī)制對(duì)于認(rèn)識(shí)凋亡發(fā)生的本質(zhì)，以及干預(yù)凋亡的發(fā)生具有重要意義。 大量研究表明，JNK/c-Jun通路的激活在神經(jīng)元凋亡過程中發(fā)揮了重要作用。比如在撤鉀處理小腦顆粒神經(jīng)元、撤

2、NGF處理的交感神經(jīng)元、β淀粉樣蛋白處理大腦皮質(zhì)神經(jīng)元或MPP<'+>/MPTP誘導(dǎo)黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡模型中，都已證明JNK被激活；激活的JNK通過磷酸化其下游底物轉(zhuǎn)錄因子c-Jun，促進(jìn)靶基因的表達(dá)，從而誘發(fā)凋亡。研究發(fā)現(xiàn)：阻斷JNK/c-Jun通路上的任何一點(diǎn)，如抑制JNK或其上游激酶MLKs，或用直接抑制c-Jun轉(zhuǎn)錄活性均能有效的干預(yù)凋亡的發(fā)生。說明JNK/c-Jun通路的活性為神經(jīng)元凋亡所必需。 體外培養(yǎng)的高純度(>95﹪

3、)小腦顆粒神經(jīng)元(cerebelar granule neuron，CGN)是神經(jīng)元凋亡及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究最經(jīng)典、最常用的細(xì)胞模型之一。體內(nèi)神經(jīng)元存活有賴于“電活性”或神經(jīng)營養(yǎng)因子的“營養(yǎng)”作用；體外原代培養(yǎng)的神經(jīng)元如CGN的存活也必須得到類似的“營養(yǎng)”作用，如用高濃度KC1模擬體內(nèi)“電活性”。當(dāng)培養(yǎng)在高濃度KC1(25 mM KC1，25 K)(簡稱為25 K處理或25 K)培養(yǎng)基的CGN分化成熟時(shí)，將培養(yǎng)基中的高濃度KC1換成低濃

4、度KCl(5 mM KC1)(簡稱為5 K處理或5 K)，CGN即發(fā)生典型的凋亡。在這一模型中，JNK/c-Jun通路激活并發(fā)揮了必不可少的促凋亡作用。JNK上游激酶MLKs抑制劑CEP11004，或JNK抑制劑SP600125可以有效地抑制凋亡的發(fā)生。更為重要的是，用多種方法直接阻斷c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性，如突變小鼠的c-Jun基因使其失去活性，顯微注射特異性c-Jun抗體干擾其功能，或采用去除轉(zhuǎn)錄激活區(qū)保留DNA結(jié)合區(qū)的負(fù)顯性c-Ju

5、n突變體阻斷c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性，均有效地干預(yù)了神經(jīng)元凋亡的發(fā)生。說明c-Jun觸發(fā)靶基因的表達(dá)對(duì)神經(jīng)元凋亡是必須的。然而，作為轉(zhuǎn)錄因子，c-Jun究竟通過觸發(fā)哪些靶基因的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)其促神經(jīng)元凋亡作用目前并不清楚。已有報(bào)道顯示FasL是c-Jun促凋亡的靶基因，但后續(xù)的研究表明突變小鼠的FasL基因使其失去活性，并不影響神經(jīng)元的凋亡。BH3-only蛋白家族的成員Bim(Bcl-2 interacting mediator of cel

6、l death，Bim)也被報(bào)道是c-Jun的促凋亡靶基因。但我們前期研究結(jié)果證明，從不同的水平阻斷JNK-c-Jun通路，并不能抑制凋亡時(shí)Bim的誘導(dǎo)表達(dá)，說明JNK/c-Jun并沒有參與Bim在神經(jīng)元凋亡時(shí)表達(dá)上調(diào)。因此c-Jun的促凋亡靶基因目前仍不清楚。 c-Jun不僅僅具有促神經(jīng)元凋亡的作用，它還參與細(xì)胞的增殖、存活、神經(jīng)元軸突的再生等一系列生物學(xué)活動(dòng)。在一些情況下，如5 K處理CGN、撤NGF處理交感神經(jīng)元、淀粉樣蛋

7、白處理大腦皮質(zhì)神經(jīng)元、MPP<'+>/MPTP誘導(dǎo)黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡時(shí)，JNK/c-Jun被激活且對(duì)凋亡的發(fā)生是必不可少的；在另一些情況下，如在背根節(jié)感覺神經(jīng)元軸突再生等，JNK/c-Jun具有抗神經(jīng)元凋亡作用。目前，對(duì)這一現(xiàn)象的解釋大多停留在“神經(jīng)元種類、發(fā)育階段或模型不同”這一水平，其分子機(jī)制仍不清楚。c-Jun屬于堿性-亮氨酸拉鏈(basic leucine zipper,bZip)蛋白成員，與其它bZip轉(zhuǎn)錄因子如c-fos家族(c

8、-fos， fral，fra2等)和ATF家族(ATF2，ATF3等)成員形成異二聚體如c-Jun/c-fos或c-Jun/ATF2才能與DNA結(jié)合，促進(jìn)靶基因的表達(dá)。因此，搭檔(partner)的不同決定了c-Jun異二聚體與靶序列結(jié)合的特異性，選擇性激活不同靶基因的表達(dá)，從而觸發(fā)不同的生物學(xué)過程。 為了從源頭尋找c-Jun的促凋亡靶基因并探索c-Jun促神經(jīng)元凋亡的分子機(jī)制，本課題主要進(jìn)行以下兩個(gè)方面的研究： 1、用

9、基因芯片的方法尋找和篩選c-Jun促凋亡靶基因。 2、研究c-Jun促神經(jīng)元凋亡的分子機(jī)制。 結(jié)果： 1、抑制JNK/c-Jun對(duì)小腦顆粒神經(jīng)元凋亡具有保護(hù)性干預(yù)作用為檢測JNK/c-Jun通路的激活，我們將體外培養(yǎng)7天的小腦顆粒神經(jīng)元，分別用25 K或5 K培養(yǎng)基處理0.5、1、2、4小時(shí)。收集蛋白后用磷酸化特異的JNK抗體檢測JNK是否激活。觀察到撤鉀處理0.5小時(shí)后JNK磷酸化水平就開始上調(diào)，并在后續(xù)的檢測

10、時(shí)間點(diǎn)持續(xù)增加，說明JNK通路激活，同一張膜上檢測到不同處理組JNK的總蛋白量保持一致，說明JNK磷酸化信號(hào)的增加不是蛋白上樣量的差異造成的。c-Jun是JNK下游底物，活化后的JNK磷酸化c-Jun的63和73位絲氨酸，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。為進(jìn)一步檢測JNK活性，我們用c-Jun磷酸化抗體(Ser73)檢測c-Jun磷酸化水平的變化，發(fā)現(xiàn)c-Jun磷酸化水平在撤鉀0.5小時(shí)后顯著增加，與JNK磷酸化變化趨勢基本一致。 2、Dp5/

11、hrk，puma，caspase-3,atf3和fn14是c-Jun的候選促凋亡靶基因?yàn)榱藦脑搭^尋找c-Jun的靶基因，我們進(jìn)行了以下研究：1.基因芯片技術(shù)：以25 K為對(duì)照，尋找5 K誘導(dǎo)的差異變化基因(25 K vs 5 K)并確定其中哪些能被Ad-△169抑制(5 K vs 5 K+△169)；2.重點(diǎn)選擇能被.Ad-△169抑制且與凋亡發(fā)生密切相關(guān)的基因進(jìn)行RT-PCR檢測，證實(shí)基因芯片的結(jié)果。 3、c-Jun靶基因啟動(dòng)

12、子都存在ATF位點(diǎn)c-Jun做為轉(zhuǎn)錄因子，需要和其他b-ZIP轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體才能結(jié)合DNA發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。不同的c-Jun二聚體對(duì)靶序列的選擇性不同，與c-fos家族成員形成的二聚體如c-Jun/c-fos主要結(jié)合經(jīng)典的7 bp的AP1序列，而與ATF家族成員形成的二聚體如c-Jun/ATF2選擇性與8 bp的ATF/CRE序列結(jié)合。因此，通過與不同的轉(zhuǎn)錄因子形成二聚體c-Jun可以選擇性觸發(fā)靶基因的表達(dá)，而明確在神經(jīng)元凋亡過程中

13、c-Jun二聚體的組成對(duì)確立和進(jìn)一步尋找c-Jun促凋亡靶基因具有非常重要的指導(dǎo)性意義。 4、神經(jīng)元凋亡時(shí)c-Jun與ATF2形成二聚體為證實(shí)這一點(diǎn)，我們首先觀察ATF家族蛋白是否激活。已有報(bào)道ATF2在CGN 5 K凋亡中激活，我們首先檢測了ATF2的磷酸化水平變化。體外培養(yǎng)七天的神經(jīng)元，分別給予25 K、5 K處理0.5、1、2、4小時(shí)。收集蛋白后進(jìn)行WesternBlot方法分析。檢測結(jié)果顯示，ATF2磷酸化水平增加，說明

14、其轉(zhuǎn)錄活性提高。我們也對(duì)c-fos的表達(dá)進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示在凋亡的極早期(1小時(shí))c-fos的mRNA和蛋白質(zhì)水平即發(fā)生顯著降低，并在以后各檢測時(shí)間點(diǎn)繼續(xù)降低。說明神經(jīng)元凋亡時(shí)c-fos基因表達(dá)是下調(diào)的。這一結(jié)果提示我們?cè)谏窠?jīng)元凋亡過程中c-Jun可能與ATF2而不是c-fos形成復(fù)合物，激活下游的促凋亡靶基因。 5、神經(jīng)元凋亡時(shí)ATF活性而不是AP1活性升高進(jìn)一步我們用報(bào)道基因的方法進(jìn)行觀察與c-Jun結(jié)合的ATF位點(diǎn)和AP

15、1位點(diǎn)在凋亡時(shí)活性的改變。5×ATF-1uc報(bào)道基因啟動(dòng)子區(qū)域含有5個(gè)串聯(lián)的ATF位點(diǎn)，當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活的c-Jun/ATF2二聚體與之結(jié)合后可觸發(fā)其下游熒光素酶的表達(dá)，與之類似，7×AP1-1uc報(bào)道基因啟動(dòng)子區(qū)域含有7個(gè)串聯(lián)的AP1位點(diǎn)，用于反映c-Jun/c-fos的轉(zhuǎn)錄活性。體外培養(yǎng)第6天的神經(jīng)元轉(zhuǎn)染等量的7×AP1-1uc或5×ATF-1uc質(zhì)粒，pCM-V-RL做為內(nèi)參質(zhì)粒12小時(shí)，然后25 K、5 K處理8小時(shí)，收集細(xì)胞并測定報(bào)

16、道基因活性。結(jié)果顯示，5×ATF-1uc在5 K處理時(shí)，活性增加4倍左右，說明與ATF位點(diǎn)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物活性增高。與此相反，7×AP1-1uc在25 K處理時(shí)活性很低，凋亡處理時(shí)沒有變化。表明，在低鉀誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡時(shí)，ATF位點(diǎn)被激活，AP1位點(diǎn)無反應(yīng)性。 6、干預(yù)c-Jun/ATF2二聚體形成保護(hù)神經(jīng)元為證明c-Jun/ATF2二聚體在神經(jīng)元凋亡中的作用，我們通過RNA干擾技術(shù)抑制c-Jun或ATF2的表達(dá)，干擾c-J

17、un/ATF2復(fù)合物的形成，觀察對(duì)低鉀誘導(dǎo)的小腦顆粒神經(jīng)元凋亡的作用。體外培養(yǎng)第5天的小腦顆粒神經(jīng)元，用鈣磷沉淀法轉(zhuǎn)染shc.Jull-a，shc-Jun-b或空質(zhì)粒BS/U6，同時(shí)共轉(zhuǎn)染pEGFP質(zhì)粒用于標(biāo)記轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。48小時(shí)后，換成25 K、5 K模型。12小時(shí)后Hoechst 33258染色顯示凋亡細(xì)胞，GFP陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)為總數(shù)，計(jì)算凋亡率。結(jié)果顯示干擾c-Jun表達(dá)后神經(jīng)元凋亡率大大下降，同樣，干擾ATF2也具有保護(hù)性干預(yù)