擬南芥GAI基因轉(zhuǎn)化小桐子的研究.pdf

1、本研究以小桐子(Jatropha curcas L.)為實(shí)驗(yàn)材料,優(yōu)化了以小桐子葉柄和葉脈為外植體的高效再生體系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:小桐子葉柄和葉脈均易于誘導(dǎo)愈傷組織,其中以MS+6-BA0.05mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L效果最佳;一周后轉(zhuǎn)入芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基,最佳芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L;將長(zhǎng)到2-3cm高的芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中

2、培養(yǎng),得到最佳的生根配方為1/2MS+IBA0.2mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5.5g/L。這為遺傳轉(zhuǎn)化奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 測(cè)定了小桐子葉脈愈傷組織對(duì)Kan的抗性,得出小桐子葉脈愈傷組織對(duì)Kan的敏感的最佳濃度為200mg/L。把來(lái)自擬南芥的控制植物莖伸長(zhǎng)的GAI基因作為目的基因,通過(guò)基因槍法和農(nóng)桿菌法分別轉(zhuǎn)化小桐子葉脈愈傷組織進(jìn)行小桐子的遺傳轉(zhuǎn)化研究。
　　 在應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法時(shí),研究了轉(zhuǎn)化材料、侵染時(shí)間、

3、共培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)溫度、抑菌素濃度、乙酰丁香酮的濃度等對(duì)農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:培養(yǎng)5d的葉脈愈傷組織,侵染5min,20℃,共培養(yǎng)2d,Cef濃度200mg/L,乙酰丁香酮濃度200μmol/L的條件下,遺傳轉(zhuǎn)化效率最好,不但可以有效抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng),而且愈傷組織侵染后可繼續(xù)生長(zhǎng)。兩周后接種到具有選擇壓的MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+Kan200mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L培養(yǎng)基中

4、進(jìn)行抗生分化篩選。分化后長(zhǎng)至2-3cm的抗性芽轉(zhuǎn)入具有選擇壓的1/2MS+IBA0.2mg/L+Kan200mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂5.5g/L生根培養(yǎng)基中生根。
　　 利用基因槍法進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn):預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、轟擊距離對(duì)小桐子的遺傳轉(zhuǎn)化率有較大影響。獲得了基因槍轉(zhuǎn)化小桐子的相關(guān)參數(shù):葉脈愈傷組織預(yù)培養(yǎng)2d,650psi,轟擊距離6cm,轟擊1次。
　　 將所得到的抗性苗提取葉脈DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),呈陽(yáng)性。擴(kuò)繁后