Ve1-FG人工融合基因的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化擬南芥研究.pdf

1、小麥?zhǔn)鞘澜缧缘募Z食作物，全世界至少有35％的人口是以小麥為主要糧食的。小麥赤霉病是一種世界潮濕和半潮濕地區(qū)廣泛發(fā)生的一種重要流行性病害。該病害不僅造成減產(chǎn)和品質(zhì)降低，致病菌所產(chǎn)生的赤霉菌毒素還會(huì)污染小麥病粒，嚴(yán)重影響食品安全和人畜健康。抗赤霉病育種仍是控制小麥赤霉病的主要途徑。但小麥抗赤霉病育種仍然面臨著種質(zhì)資源相對(duì)匱乏、抗病品種農(nóng)藝性狀欠佳及育種周期漫長(zhǎng)等困難。
　　 通過(guò)植物基因工程可有針對(duì)性的將抗病相關(guān)基因?qū)敫胁∑贩N中改

2、良其抗病性，轉(zhuǎn)基因工程株可以在保持原有受體品種的農(nóng)藝性狀的基礎(chǔ)上提高抗病性。因此，本研究試圖利用野生番茄上的抗黃萎病基因(Ve1)和小麥赤霉病的病原菌自身識(shí)別基因進(jìn)行人工重組，并通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)和Western雜交，以驗(yàn)證人工重組基因是否正確表達(dá)，為后續(xù)在植物體內(nèi)測(cè)試重組基因的功能奠定基礎(chǔ)，探索抗病新策略。取得以下主要研究結(jié)果:
　　 根據(jù)在番茄上已經(jīng)克隆到的抗黃萎病基因(Ve1)的序列，進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，推測(cè)Ve1基因1525-18

3、20nt為抗病識(shí)別區(qū)域;該識(shí)別區(qū)域與所抗目標(biāo)病害黃萎病原菌基因組識(shí)別蛋白基因VDBG-096011465-1755nt區(qū)間，一致性為21％（61％為陽(yáng)性）。小麥赤霉病原菌基因組內(nèi)存在與VDBG-09601同源的基因FGSG08285，一致性達(dá)55％（陽(yáng)性率69％），但在上述識(shí)別區(qū)域內(nèi)無(wú)相似性。本研究通過(guò)融合Ve1基因及FGSG_08285基因，以期實(shí)現(xiàn)改造后的Ve1基因能夠識(shí)別小麥赤霉病菌從而達(dá)到抗病的全新策略。為了構(gòu)建該融合基因，擴(kuò)增

4、出Ve1基因1-1524nt和1821-3159nt兩個(gè)片段以及小麥赤霉病FGSG_08285基因1561-1857nt片段，三個(gè)片段大小分別為1524bp，1338bp，297bp。通過(guò)Fusion PCR方法構(gòu)建Ve1-FGSG08285（簡(jiǎn)稱Ve1-FG）融合基因，全長(zhǎng)為3159bp。經(jīng)融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及Western雜交，結(jié)果表明該融合基因與非融合Ve1基因一致，具有表達(dá)活性，為可溶性蛋白，表達(dá)產(chǎn)物大小為117KDa，為后續(xù)基因

5、抗病功能測(cè)試奠定基礎(chǔ)。利用半定量RT-PCR對(duì)該基因的組織表達(dá)特異性進(jìn)行分析，表明Ve1-FG在根和莖中表達(dá)量較高，在葉中和果實(shí)中表達(dá)量較低。
　　 構(gòu)建植物表達(dá)載體pCXSN-Ve1-FG，利用農(nóng)桿菌花序侵染法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥;通過(guò)潮霉素抗性、PCR及RT-PCR篩選鑒定擬南芥植株，初步證明外源基因已經(jīng)整合到擬南芥基因組中。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥苗進(jìn)行抗病性分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)禾谷鐮刀菌的抗病性比對(duì)照植株強(qiáng)。轉(zhuǎn)基因擬南芥苗和