中華蜜蜂頭部ESTs文庫構(gòu)建和主要觸角特異蛋白基因克隆、定位及其表達(dá)鑒定.pdf

1、中華蜜蜂apes cerana cerana(簡稱中蜂)為原產(chǎn)我國的本土蜜蜂，具有較西方蜜蜂Apis mellifera L(簡稱西蜂)更敏銳的嗅覺，如具有善于利用零星蜜源的能力，通常氣味結(jié)合蛋白OBPs直接參與了嗅覺感器識別感知外界氣味分子的過程；另外中蜂有著敏銳準(zhǔn)確的鑒別能力和強(qiáng)烈的排異性，及作為原始寄主對雅氏瓦螨Varroa jacobsoni的適應(yīng)抗性，化學(xué)感受蛋白CSPs可能直接參與了中蜂的這種排異行為以及抗螨過程。

2、本論文通過構(gòu)建cDNA文庫并結(jié)合批量ESTs測序，對中蜂頭部功能基因進(jìn)行了分析。在此基礎(chǔ)上，著重通過對中蜂主要的觸角特異蛋白——Ac-ASP1，Ac-ASP2(氣味結(jié)合蛋白OBPs)和Ac-ASP3(化學(xué)感受蛋白CSPs)進(jìn)行基因克隆，并通過其在觸角中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜和在觸角不同感器內(nèi)的亞細(xì)胞定位，以期對上述分子進(jìn)行鑒定，最終對揭示中蜂靈敏的嗅覺以及獨(dú)特的排異和抗螨能力奠定重要的基礎(chǔ)。具體的研究結(jié)果如下： 1．構(gòu)建了包含十三個(gè)日齡的

3、中蜂頭部cDNA文庫。通過LD-PCR技術(shù)有效地合成出全長ds-cDNA和組織中低豐度的mRNA，電泳結(jié)果顯示，合成的ds-cDNA在0.6～1.0kb之間有數(shù)條可見的條帶，顯示為高豐度的基因。對未擴(kuò)增文庫和擴(kuò)增文庫分別采用PCR擴(kuò)增和藍(lán)白斑鑒定的方法證明構(gòu)建文庫的重組率較高(重組率分別達(dá)到90％和97.6％)，且?guī)烊莞?未擴(kuò)增文庫的滴度達(dá)到1.25×10<'6>pfu/ml，擴(kuò)增文庫的滴度約為1.74×10<'9>pfu/ml)。

4、 2．基于構(gòu)建好的中蜂cDNA文庫，利用批量化ESTs測序策略，成功得到了質(zhì)量較好的有效ESTs序列862條，經(jīng)拼接后分別得到“Contig”和“Singleton”序列68個(gè)和184個(gè)。將拼接后的序列進(jìn)行注釋，ESTs庫中存在相當(dāng)數(shù)量的高豐度基因，如王漿蛋白1(major royaljelly protein 1，MRJP1)，王漿蛋白2(major royalielly protein 2，MRJP2)，葡萄糖氧化酶(gluco

5、se oxidase，GOX)和王漿多肽(Apisimin)等，以及與觸角信息傳遞相關(guān)蛋白如氣味結(jié)合蛋白OBPl5等多種功能基因，為以后的研究提供了基礎(chǔ)。 3．根據(jù)西方蜜蜂的研究，我們從中蜂觸角中首次克隆TAc-ASP1，Ac-ASP2與Ac-ASP3等三個(gè)主要的觸角特異蛋白基因序列ORF全長，GenBank登錄號分別為DQ449670、DQ449667與DQ449669。序列分析可知Ac-ASP1，Ac-ASP2均具有6個(gè)保守

6、的半胱氨酸，而Ac-ASP3具有4個(gè)保守的半胱氨酸。通過多序列聯(lián)配、系統(tǒng)發(fā)育樹及序列相似性分析，Ac-ASP除與西方蜜蜂Am-ASP親緣關(guān)系較近(相似性達(dá)到80％以上)外，與其它膜翅目以及鞘翅目的OBPs及CSPs也有一定的親緣關(guān)系(相似性達(dá)到30～60％)，且Ac-ASP1和Ac-ASP2應(yīng)為OBPs，Ac-ASP3則應(yīng)為CSPs。 4．利用Real-time PCR技術(shù)，分析了Ac-ASP1，Ac-ASP2與Ac-ASP3基

7、因的時(shí)空表達(dá)情況，結(jié)果表明該三個(gè)基因的表達(dá)模式為：Ac-ASP1高豐度地表達(dá)于工蜂觸角，而在其它器官(如頭、胸、腹、翅及足)中呈低豐度表達(dá)；Ac-ASP2特異地表達(dá)于工蜂觸角，在其它器官中均不表達(dá)；Ac-ASP3除在觸角中表達(dá)外在其它器官中也表達(dá)，但表達(dá)豐度不均一。在各發(fā)育歷期中，Ac-ASP1在幼蟲、蛹期到6日齡以及21日齡前后具有兩個(gè)表達(dá)高峰，二者表達(dá)豐度相當(dāng)；Ac-ASP2在幼蟲及蛹中均不表達(dá)，在成蟲中具有幾個(gè)豐度較高的日齡，即1

8、、9、15、27、30日齡，這兩個(gè)高表達(dá)時(shí)期均要較其它時(shí)期高出近十倍以上：Ac-ASP3在從蛹期到6日齡以及18日齡前后具有兩個(gè)表達(dá)高峰，其中前者的平均表達(dá)豐度約為后者的兩倍。 5．對中蜂主要的觸角特異蛋白基因序列中的普通氣味結(jié)合蛋白Ac-ASP2和化學(xué)感受蛋白Ac-ASP3進(jìn)行了原核表達(dá)，其中Ac-ASP2為包涵體表達(dá)，而Ac-ASP3為可溶性表達(dá)。二者分別通過梯度尿素洗滌和鎳NTA瓊脂糖凝膠親和層析純化，每升LB培養(yǎng)基分別可

9、以得到50mg和15mg的抗原量。從純化效果看，Ac-ASP3純度要Ac-ASP2高，但是后者的得率要比前者高。二者均作為免疫抗原制備了多抗血清，經(jīng)雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)測定效價(jià)，Ac-ASP2和Ac-ASP3的抗血清效價(jià)分別達(dá)到1∶32和1∶64，特異性好且效價(jià)高，完全符合免疫探針制備要求。 6．制備了Ac-ASP2和Ac-ASP3相應(yīng)的膠體金探針。利用免疫電鏡對中蜂Ac-ASP2和Ac-ASP3在觸角感器中進(jìn)行亞細(xì)胞定位鑒定，其中

10、Ac-ASP2表達(dá)于板形感器(sensilla placodea，sp)、毛形感器A(sensilla trichoidea A，stA)等嗅覺感器，表明Ac-ASP2參與中蜂觸角嗅覺識別機(jī)制；Ac-ASP3則主要表達(dá)于錐形感器(sensilla basiconica，sb)和毛形感器B(sensilla trichoidea B，stB)等機(jī)械感器內(nèi)，表明Ac-ASP3可能參與中蜂觸角的機(jī)械運(yùn)動。對于最終揭示兩者在中蜂嗅覺系統(tǒng)及化學(xué)感