桿狀病毒DNA甲基化及其病毒基因表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、DNA甲基化現(xiàn)象在病毒基因組中廣泛存在，且在病毒基因表達(dá)調(diào)控和與宿主相互作用中發(fā)揮重要作用。相關(guān)的表觀遺傳學(xué)研究多集中在潛伏性病毒或非裂解性病毒中，如Epstein-Barr病毒(EBV)、人乳頭瘤病毒（HPV）、乙型肝炎病毒(HBV)，而像桿狀病毒這樣的裂解性病毒較少研究。本文研究了桿狀病毒模式株苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multicapsid nuclearpolyhedrosis v

2、irus)基因組若干基因的DNA甲基化狀態(tài)，以及感染過程中甲基化狀態(tài)的變化，和ie0/ie1啟動子區(qū)域DNA甲基化與其基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)聯(lián)。
　　首先，通過軟件預(yù)測、MBD（甲基化CpG結(jié)合域）蛋白富集等方法，對病毒基因組中某些特定基因的CpG島進(jìn)行亞硫酸氫鹽測序，發(fā)現(xiàn)AcMNPV基因組整體甲基化水平較低，但不同基因的甲基化程度存在較大差異。ie0、p95區(qū)域的甲基化程度相對較高，為甲基化熱點區(qū)域，而ie1啟動子、gp64、gp41

3、、hr3等區(qū)域甲基化程度較低，有些幾乎沒有甲基化。ie0/ie1是一對重要的極早期基因，其啟動子甲基化狀態(tài)存在明顯差異，可能具有重要意義。
　　為了解病毒感染過程中DNA甲基化狀態(tài)變化，對感染過程中不同時間的DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)ie0啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)隨著感染過程發(fā)生變化，感染后4h開始檢測到甲基化，到感染后8h其甲基化程度明顯下降，隨后開始上升，到子代病毒粒子里達(dá)到最高。對p95區(qū)域的檢測也顯示了相同的趨勢

4、。這一結(jié)果表明病毒感染過程中，病毒基因組中的甲基化熱點區(qū)域的甲基化狀態(tài)不是恒定不變的，隨著感染過程的進(jìn)行，其甲基化狀態(tài)發(fā)生著變化，這一變化的機(jī)制尚不清楚，可能與基因的時序性表達(dá)有關(guān)。
　　為了研究啟動子甲基化對其活性及表達(dá)調(diào)控的影響，構(gòu)建了表達(dá)IE0和IE1蛋白的質(zhì)粒p402-ie1、p402-ie0M-A，及由ie0和ie1啟動子表達(dá)熒光素酶的報告質(zhì)粒pie0p-luc、pie1p-luc，采用體外甲基化和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染瞬時表達(dá)的方式

5、，研究了DNA甲基化對IE0、IE1調(diào)控自身啟動子作用的影響。結(jié)果證實ie0p受IE0蛋白激活，而受到IE1蛋白抑制，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化極大降低ie0p、ie1p活性。驗證了IE0、IE1蛋白對于ie1p的激活作用，而甲基化后IE1/IE0對其激活作用依然保持。用不同比例的p402-ie1/p402-ie0M-A和甲基化報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在IE0＞IE1時，甲基化能夠逆轉(zhuǎn)IE0/IE1對于ie0p的調(diào)控作用。這些結(jié)果表明，DNA甲基