甘藍(lán)型油菜隱性核不育基因Bnms1的精細(xì)定位和克隆.pdf

1、雜種優(yōu)勢(shì)利用是提高油菜產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性的有效途徑。雄性不育是油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用主要的途徑，但是對(duì)于雄性不育機(jī)理的研究卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后。甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育(GMS)敗育徹底，不育性表現(xiàn)穩(wěn)定，細(xì)胞質(zhì)來(lái)源豐富，恢復(fù)源廣泛，在國(guó)內(nèi)已成為油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用的重要途徑之一。S45AB來(lái)源于四川大學(xué)，由潘濤等(1988)在Oro中發(fā)現(xiàn)的自然突變體衍生而來(lái)，經(jīng)過(guò)多代的兄妹交(25代以上)保存，通過(guò)雜交試驗(yàn)證明S45A的不育性受兩對(duì)重疊隱性基因控制(潘濤等，

2、1988)。在近等基因系S45AB中，一個(gè)不育位點(diǎn)處于雜合狀態(tài)，另外一個(gè)不育位點(diǎn)處于隱性純合狀態(tài)。本研究以S45AB作為基礎(chǔ)材料，對(duì)處于雜合狀態(tài)的隱性核不育基因進(jìn)行了遺傳定位和克隆的研究，主要結(jié)果如下：
　　 1.3年的育性調(diào)查結(jié)果表明：兄妹交后代的育性分離比穩(wěn)定在1∶1，可育株自交后代的育性比例符合3∶1。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了在兩型系S45AB中控制育性的兩個(gè)位點(diǎn)中只有一個(gè)處于分離狀態(tài)，我們將這個(gè)位點(diǎn)的不育基因命名為Bnms1

3、；另外一個(gè)位點(diǎn)處于隱性純合狀態(tài)，不育基因命名為Bnms2。
　　 2.半薄切片觀察發(fā)現(xiàn)可育花藥和不育花藥在減數(shù)分裂前沒有明顯差異。四分體時(shí)期四分體沒有明顯差異，不育花藥的絨氈層比可育花藥的稍厚。在單核花粉期小孢子差異明顯，不育小孢子沒有花粉外壁的合成，發(fā)育長(zhǎng)時(shí)間停留在單核花粉期并最終解體；不育花藥的絨氈層表現(xiàn)為徑向擴(kuò)大，液泡化明顯。S45A敗育發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期在四分體至單核花粉期，絨氈層異常、花粉外壁的缺失是導(dǎo)致敗育的主要原因。<

4、br>　　 3.應(yīng)用AFLP與BSA結(jié)合的方法分析近等基因系S45AB，共篩選了2560對(duì)AFLP引物組合，獲得7個(gè)與目的基因(Bnms1)連鎖的AFLP標(biāo)記AF1-AF7。用包含310個(gè)單株的近等基因系群體將Bnms1基因定位在標(biāo)記AF3和AF7之間，標(biāo)記與基因間的遺傳距離分別為1.6cM和0.3cM，標(biāo)記AF1和AF2與基因共分離。
　　 4.回收、克隆了以上7個(gè)AFLP特異片段，測(cè)序結(jié)果表明AF1-AF7的精確長(zhǎng)度分別為

5、203bp、241bp、211bp、186bp、187bp、284bp和362bp。通過(guò)PCR-walking分離AFLP標(biāo)記的側(cè)翼序列，將AF1、AF3、AF6和AF7分別延長(zhǎng)至7,499bp、997bp、1,203bp和656bp，并轉(zhuǎn)化為4個(gè)SCAR標(biāo)記SC1、SC3和SC6和SC7。用1,974個(gè)單株的S45AB近等基因系將Bnms1基因定位在標(biāo)記SC1和SC7之間，標(biāo)記與Bnms1基因間的遺傳距離分別為0.1cM和0.3cM。

6、
　　 5.利用DH群體(Zhongyou821×Bao604)為作圖群體，構(gòu)建了一張包含237個(gè)標(biāo)記的遺傳圖譜，圖譜總長(zhǎng)1,625.6cM，包括2個(gè)RFLP標(biāo)記，65個(gè)RAPD標(biāo)記，86個(gè)SSR標(biāo)記，84個(gè)SRAP標(biāo)記。利用兩個(gè)DH群體(Tapidor×Ningyou7、Zhongyou821×Bao604)的遺傳圖譜將不育基因Bnms1定位于N7連鎖群，并在N7連鎖群上找到一個(gè)與Bnms1基因連鎖的共顯性標(biāo)記Na12A02，

7、Na12A02與基因的距離為2.6cM。
　　 6.以分子標(biāo)記SC7、SC1和SC6的特異片段為探針篩選Tapidor BAC文庫(kù)，得到41個(gè)陽(yáng)性克隆。利用標(biāo)記SC1和SC7將Bnms1基因定位在BAC克隆BAC1上，對(duì)克隆BAC1進(jìn)行shotgun測(cè)序。基于BAC序列開發(fā)了6個(gè)新標(biāo)記SC8-SC13，在4132個(gè)單株群體中Bnms1基因被定位在標(biāo)記SC8和SC11之間，標(biāo)記與Bnms1基因間的遺傳距離分別為0.05cM和0.1

8、5cM，SC8和SC11在BAC克隆BAC1上的物理距離為21.2-kb。
　　 7.用21.2-kb的序列檢索GenBank的EST數(shù)據(jù)庫(kù)和擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)(AGIGenes)，結(jié)果表明該區(qū)域存在四個(gè)候選基因，四個(gè)候選基因在甘藍(lán)型油菜上的排列順序與擬南芥基因的排列順序一致。第一個(gè)和第四個(gè)候選基因是功能未知的基因，第二個(gè)候選基因?qū)儆贜AP類型基因，第三個(gè)候選基因是CYP450基因家族成員，分析認(rèn)為第二和第三個(gè)候選基因可能與花粉發(fā)育相

9、關(guān)，以下用G14、G15表示。
　　 8.Northern blot分析表明G14和G15的表達(dá)量在S45A和S45B之間沒有明顯差異。在小于1mm、1mm～2mm、2mm～3mm和3mm～4mm四種大小的花蕾之間G14的表達(dá)量沒有變化，表達(dá)水平很低；G15在1mm～2mm、2mm～3mm大小的的花蕾中特異表達(dá)。
　　 9.比較測(cè)序發(fā)現(xiàn)，G14在S45A和S45B之間存在2個(gè)錯(cuò)義突變，導(dǎo)致第79位的纈氨酸突變?yōu)楸彼幔坏?/p>