同源序列法克隆甘藍(lán)型油菜核不育基因BnMS1及其功能研究.pdf

1、雄性不育是指植物在有性繁殖過(guò)程中不能產(chǎn)生正常的花藥、花粉或雄配子而雌蕊功能正常的現(xiàn)象。雄性不育廣泛應(yīng)用于雜交育種中,圖位克隆核不育基因費(fèi)時(shí)費(fèi)力。目前為止,雖已對(duì)許多與細(xì)胞核雄性不育相關(guān)基因進(jìn)行分子標(biāo)記與定位,但尚未有圖位克隆到甘藍(lán)型油菜不育基因的報(bào)道。
　　 油菜與擬南芥同屬十字花科蕓薹屬植物,比較基因組學(xué)研究證明油菜與擬南芥基因組同源性很高,這意味著可以利用擬南芥育性相關(guān)基因克隆油菜的雄性不育基因以及開展育性相關(guān)性的研究。目前

2、已分離的擬南芥育性相關(guān)基因有:.MS2基因、MS5基因、Col1基因、spl基因、MS1基因、eMS1基因、dde2-2基因和mmd1基因等。其中擬南芥MS1只在小孢子釋放時(shí)期的絨氈層組織中低豐度表達(dá),擬南芥MS1突變體能導(dǎo)致花粉敗育而對(duì)其它花器官的生長(zhǎng)發(fā)育沒(méi)有影響,這在生產(chǎn)上有較大的應(yīng)用價(jià)值。
　　 因此本研究圍繞擬南芥核不育基因MS1開展了以下工作:
　　 1.克隆甘藍(lán)型油菜核不育基因BnMS1及生物信息學(xué)分析:根據(jù)

3、擬南芥MS1基因保守區(qū)域序列設(shè)計(jì)特異性引物,PCR擴(kuò)增甘藍(lán)型油菜超油二號(hào)基因組,將PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序,并將所得序列拼接。根據(jù)所得序列兩端設(shè)計(jì)引物,利用PCRWalking技術(shù)克隆該基因全長(zhǎng)。將克隆的基因序列全長(zhǎng)與擬南芥MS1基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行同源性比對(duì)及生物信息學(xué)分析。結(jié)果:BnMS1基因全長(zhǎng)3424bp,BnMS1與MS1全長(zhǎng)序列同源性60.3％；BnMS1與MS1編碼序列同源性89.5％:BnMS1基因外顯子分別位于521bp-+82

4、1bp、1189bp-+1471bp、1876bp-+3296bp:內(nèi)含子分別位于822bp-+1188bp、1472bp-+1875bp；開放閱讀框長(zhǎng)2004bp,編碼667個(gè)氨基酸,蛋白分子量為76.5KD,等電點(diǎn)為8.01；根據(jù)BnMS1基因序列推測(cè)的蛋白質(zhì)氨基酸序列與已知擬南芥MS1基因蛋白質(zhì)氨基酸序列同源性達(dá)到93％。
　　 2.構(gòu)建BnMS1基因反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥。克隆BnMS1基因第三個(gè)外顯子2402.2919

5、bp序列命名為antiMS,反向插入pFGC5941植物表達(dá)載體中,并轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中。T1代種子播種,種子萌發(fā)3-5d后噴施除草劑篩選抗性植株,后期提取DNA進(jìn)行PCR鑒定,提取花RNA進(jìn)行RT-PCR,并觀察植株生長(zhǎng)情況,對(duì)花粉進(jìn)行取樣,碘、碘化鉀染色,在顯微鏡下觀察。結(jié)果:轉(zhuǎn)anti-MS擬南芥共篩選到14株,PCR陽(yáng)性植株11株,植株表型、花粉粒數(shù)目活性與野生型無(wú)區(qū)別,RT-PCR均擴(kuò)出條帶且與野生型無(wú)明差異。
　　 3.

6、構(gòu)建擬南芥MS1基因人工小RNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥。根據(jù)Schwab的方法構(gòu)建擬南芥MS1基因amiRNA載體,并與pFGC5941表達(dá)載體連接,并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。利用花絮浸潤(rùn)法轉(zhuǎn)化擬南芥,轉(zhuǎn)化種子播種,種子萌發(fā)3-5d后噴施除草劑篩選抗性植株,后期提取DNA進(jìn)行PCR鑒定,提取花RNA進(jìn)行RT-PCR,并觀察植株生長(zhǎng)情況,對(duì)花粉進(jìn)行取樣,碘、碘化鉀染色,在顯微鏡下觀察。結(jié)果:轉(zhuǎn)amiRNA載體擬南芥共篩選到27株轉(zhuǎn)化株,PCR陽(yáng)性植株2

7、5株,其中8株轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出中間型雄性不育的性狀:植株部分莢短小不育,在早期花中觀察到花粉囊中含有數(shù)目極少的花粉粒,后期與野生型并無(wú)明顯區(qū)別,其余轉(zhuǎn)基因植株與野生型無(wú)區(qū)別。
　　 4.構(gòu)建BnMS1啟動(dòng)子序列與pGUS-eGFP雙標(biāo)記連接的植物表達(dá)載體。PCR克隆BnMS1啟動(dòng)子序列,將啟動(dòng)子序列與pGUS-eGFP雙標(biāo)記連接的植物表達(dá)載體連接,并轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中,以待轉(zhuǎn)化擬南芥,驗(yàn)證啟動(dòng)子是否具有功能。對(duì)重組農(nóng)桿菌的PCR結(jié)果