禾谷鐮孢菌Fusarium graminearum Schwabe兩個β-微管蛋白基因功能及對多菌靈的抗藥性分子機理.pdf

1、微管是構(gòu)成真核生物細胞骨架的主要成分，在細胞的生命活動過程中起重要作用α-和β-微管蛋白是構(gòu)成微管的主要成分，而β-微管蛋白也是多菌靈等苯并咪唑殺菌劑的作用靶標，其特定位點的突變將導致苯并咪唑殺菌劑抗性。禾谷鐮孢菌是我國引起小麥赤霉病的主要病原菌，多菌靈是防治該病害的主要藥劑之一，但多菌靈對禾谷鐮孢菌的作用表型及禾谷鐮孢菌對多菌靈的抗性表型與其它植物病原真菌有差異。
　　 本論文通過觀察多菌靈對禾谷鐮孢菌的細胞學尤其是有絲分裂的

2、影響，明確多菌靈對禾谷鐮孢菌的作用機制；通過研究禾谷鐮孢菌兩個β-微管蛋白基因的敲除突變體、與GFP的融合表達突變體的形態(tài)學和生理學表型、兩者在菌體不同階段的表達差異以及兩個β-微管蛋白在細胞內(nèi)的定位，從而明確禾谷鐮孢菌兩個β-微管蛋白基因的關(guān)系以及在禾谷鐮孢菌生命活動過程中的作用，確定多菌靈對禾谷鐮孢菌的作用靶標及禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性的機理，從而為禾谷鐮孢菌的抗藥性治理以及以新的微管蛋白靶標藥劑的設(shè)計提供重要的理論依據(jù)。
　　

3、 1禾谷鐮孢菌分生孢子萌發(fā)過程中核相變化及有絲分裂過程觀察
　　 本研究通過Giemsa染色觀察禾谷鐮孢菌分生孢子萌發(fā)過程中的核相變化及有絲分裂過程。觀察表明，分生孢子細胞為單核，細胞核在分生孢子細胞內(nèi)分裂后進入芽管，在芽管內(nèi)進行多次分裂，使芽管內(nèi)細胞核數(shù)目不斷變化。禾谷鐮孢菌有絲分裂過程可以分為4個時期，前期染色體逐漸濃縮變短，中期染色體清晰可見，后期染色單體發(fā)生分離并向相反的兩極移動，末期形成新的子核。有絲分裂過程中染色體

4、的分離同步或不同步，不同步分離中的滯后染色體形成后期橋的現(xiàn)象更為普遍。
　　 2多菌靈對禾谷鐮孢菌分生孢子萌發(fā)和有絲分裂的影響
　　 已有研究結(jié)果表明多菌靈對灰葡萄孢菌Botrytis cinerea等多種真菌的作用機制是抑制有絲分裂，其β-微管蛋白發(fā)生突變是抗藥性產(chǎn)生的原因。本研究通過比較多菌靈對禾谷鐮孢菌和灰葡萄孢菌分生孢子萌發(fā)以及幼殖體內(nèi)有絲分裂的影響，以探明多菌靈對禾谷鐮孢菌的作用機制以及禾谷鐮孢菌對多菌靈的抗性

5、機制。
　　 禾谷鐮孢菌野生型（多菌靈敏感）菌株的分生孢子在多菌靈處理條件下萌發(fā)產(chǎn)生的幼殖體發(fā)生扭曲、分支增多、伸長受到抑制；其分生孢子在無藥劑條件下產(chǎn)生的幼殖體在多菌靈處理條件下產(chǎn)生相同的特征。在藥劑處理條件下細胞核不能正常地進行有絲分裂，染色體呈散亂分布。同時，染色體有絲分裂指數(shù)（CMI值）在藥劑處理后60min內(nèi)很快升高，然后又快速下降。多菌靈處理灰葡萄孢菌野生型菌株產(chǎn)生相同的形態(tài)學和細胞學特征。
　　 灰葡萄孢菌

6、多菌靈抗性菌株在藥劑處理條件下能進行正常的萌發(fā)、生長及有絲分裂。但是，禾谷鐮孢菌多菌靈抗性菌株在藥劑處理條件下分支增多、CMI值有顯著的變化，盡管未見有絲分裂受到明顯的影響。
　　 以上研究結(jié)果表明，同灰葡萄孢菌一樣，多菌靈對禾谷鐮孢菌的作用機制也是抑制其有絲分裂，但兩者的抗性機制有差異。
　　 3多菌靈對禾谷鐮孢菌的作用靶標
　　 本研究分別敲除禾谷鐮孢菌的β1、β2-微管蛋白基因，并測定各敲除突變體菌株對多菌

7、靈的敏感性，結(jié)果表明，敲除其中任意一個β-微管蛋白基因的突變體菌株都對多菌靈敏感，但敏感性有差異。同時獲得綠色熒光蛋白GFP基因與禾谷鐮孢菌的β1、β2-微管蛋白基因的融合突變體菌株，通過熒光顯微觀察多菌靈對禾谷鐮孢菌β1、β2-微管蛋白的敏感性差異，結(jié)果同樣表明兩β-微管蛋白與多菌靈的敏感性有差異。
　　 以上研究結(jié)果表明禾谷鐮孢菌的β1、β2-微管蛋白都是多菌靈等苯并咪唑殺菌劑的作用靶標，但兩β-微管蛋白與多菌靈的敏感性有差

8、異，這種差異可能是由于兩者240位氨基酸的不同而導致的.同時，研究還表明禾谷鐮孢菌熒光蛋白標記的β-微管蛋白基因可以同源替換內(nèi)源的同一β-微管蛋白基因，甚至兩個內(nèi)源β-微管蛋白基因都可以同時替換，并能正常表達，且對目標蛋白的生物學功能沒有影響。
　　 4禾谷鐮孢菌兩個β-微管蛋白基因功能
　　 本研究通過測定禾谷鐮孢菌β1、β2-微管蛋白基因敲除突變體菌株的營養(yǎng)生長特性、生殖生長能力、細胞有絲分裂過程及其致病性等方面的生

9、物學特性，以確定兩個β-微管蛋白基因功能的差異。研究結(jié)果表明，β1-微管蛋白基因敲除突變體菌株的生物學表型與野生菌株差異不顯著；而敲除β2-微管蛋白基因的突變體菌株盡管也能完成其生活史，但其菌絲生長變慢、分支增多、無性及有性生殖能力下降、致病力降低。由此可以看出β2-微管蛋白基因?qū)坦如犳呔潜匦璧亩?-微管蛋白基因是非必需的，但是兩者在功能上是可以相互替代的。同時用熒光蛋白基因標記這兩個β-微管蛋白基因以測定其時空表達，結(jié)果顯示禾谷

10、鐮孢菌β1、β2-微管蛋白基因在各時期的菌體細胞內(nèi)均是同時表達的，并都參與微管的組裝。該結(jié)果進一步說明兩者在功能上是互補的。
　　 以上研究結(jié)果表明禾谷鐮孢菌β1、β2-微管蛋白基因在各種菌體細胞內(nèi)均是同時表達的，并都參與微管的組裝；兩者在生物學功能上有些差異，但是在功能上互補.
　　 5禾谷鐮孢菌對多菌靈抗性的分子機理
　　 大多數(shù)植物病原真菌苯并咪唑殺菌劑抗性的產(chǎn)生是由于β-微管蛋白基因發(fā)生突變。禾谷鐮孢菌具

11、有兩個β-微管蛋白基因，前期研究表明其多菌靈抗性菌株β1-微管蛋白基因未發(fā)生突變，而僅β2-微管蛋白基因發(fā)生突變，其突變主要發(fā)生在編碼167、198和200位氨基酸的堿基上.
　　 為了進一步證明β2-微管蛋白基因突變與多菌靈抗性的關(guān)系，本研究選取一株禾谷鐮孢菌田間多菌靈高抗菌株，分別敲除其β1、β2-微管蛋白基因，測定各敲除突變體菌株的多菌靈敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除β2-微管蛋白基因的突變體菌株對多菌靈超敏感，并且與野生菌株β2-

12、微管蛋白基因敲除突變體菌株對多菌靈的敏感性一致；而敲除β1-微管蛋白基因的突變體菌株對多菌靈超高抗。Giemsa染色觀察多菌靈處理這兩類敲除突變體對其有絲分裂的影響，結(jié)果也證實了它們對多菌靈敏感性的變化。應(yīng)用綠色熒光蛋白GFP標記同一田間抗性菌株的β1、β2-微管蛋白，熒光顯微觀察多菌靈的作用，結(jié)果進一步直接證實了該菌株β2-微管蛋白對多菌靈敏感性的降低。同時分別用禾谷鐮孢菌多菌靈田間抗性的4種突變方式的β2-微管蛋白基因來恢復野生菌株