禾谷鐮孢菌β-微管蛋白的原核表達(dá)、復(fù)性純化和單克隆抗體的制備.pdf

1、小麥赤霉病是我國(guó)小麥上最重要的病害之一。目前在植物病害綜合防治體系中，使用苯并咪唑類(lèi)殺菌劑（如多菌靈）是防治這種病害最常用、最有效的措施。但據(jù)近幾年的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，病原菌對(duì)該類(lèi)殺菌劑的抗性群體發(fā)展迅速。據(jù)本實(shí)驗(yàn)室研究，小麥赤霉病對(duì)多菌靈（MBC）的抗性主要是由于禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum.Retch）的β2-微管蛋白基因突變引起的，該蛋白第167位、198位、200位等氨基酸的突變都會(huì)引起不同水平的抗性，本文利用原

2、核表達(dá)技術(shù)構(gòu)建了β2-微管蛋白不同突變位點(diǎn)基因的表達(dá)載體，并制備了野生型菌株β2-微管蛋白的單克隆抗體。為研究其抗性產(chǎn)生的原理和蛋白質(zhì)與藥物的互作奠定了基礎(chǔ)。
　　 本文分別擴(kuò)增了禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈敏感菌株（MBCs）的β1-微管蛋白基因（β1-S）和β2-微管蛋白基因（β2-S），及對(duì)多菌靈中抗菌株（MBCMR）和高抗菌株（MBCHR）的β2-微管蛋白基因（β2-MR和β2-HR），測(cè)序后構(gòu)建了原核表達(dá)載體β1-S/pET28

3、a，β2-S/pET28a，β2-MR/pET28a，β2-HR/pET28a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta（DE3）pLysS。經(jīng)IPTG（1 mM）誘導(dǎo)后，得到了C末端融合6×His純化標(biāo)簽的表達(dá)產(chǎn)物，產(chǎn)物SDS-PAGE電泳分析和Western blot驗(yàn)證，表明在大腸桿菌中表達(dá)了分子量約50 kD的蛋白，和預(yù)測(cè)蛋白大小一致，并且表達(dá)的蛋白能與抗His標(biāo)簽的單抗發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　 在原核表達(dá)系統(tǒng)，由于構(gòu)建的表達(dá)載體能夠

4、進(jìn)行高效表達(dá)，使得表達(dá)的目標(biāo)蛋白濃度太高而形成包涵體，亦或在原核表達(dá)系統(tǒng)中缺少真核表達(dá)系統(tǒng)中的修飾體系，而形成包涵體。包涵體蛋白是沒(méi)有生物活性的蛋白，必須經(jīng)過(guò)溶解、復(fù)性和純化才能進(jìn)一步使用，本文以MBCs菌株β2-微管蛋白（β2-S）為例，優(yōu)化了包涵體洗滌條件，比較了兩種復(fù)性方法（直接透析復(fù)性和稀釋后透析復(fù)性）和三種純化方法（His-TrapHP預(yù)裝柱純化法、離子交換純化法、PD-10重力柱純化法），最終選用含3 M尿素的洗滌液進(jìn)行包涵

5、體的洗滌，用先稀釋后復(fù)性的方法進(jìn)行包涵體復(fù)性，用PD-10重力柱純化法純化目標(biāo)蛋白。
　　 將復(fù)性純化后的β2-S作為抗原，常規(guī)免疫小鼠，4周后當(dāng)小鼠血清效價(jià)達(dá)到1：6500時(shí)進(jìn)行融合，待觀察到雜交瘤細(xì)胞后，以純化的β2-S包被酶標(biāo)板，進(jìn)行反復(fù)間接EIASA檢測(cè)后，得到3株雜交瘤細(xì)胞株H1、H2、H3，分別進(jìn)行單克隆，得到相對(duì)應(yīng)的單克隆細(xì)胞株4株（MAb1-1、MAb1-2、MAb2-1、MAb3-1）。用復(fù)性純化β2-S的方法