丙酮酸在禾谷鐮孢菌DON毒素合成途徑中的調(diào)控作用.pdf

1、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）能夠侵染小麥等禾谷類作物產(chǎn)生小麥赤霉病。小麥赤霉病分布很廣、破壞性很強(qiáng)，在世界范圍內(nèi)都有傳播。我們國家從1970年以來一直采用以多菌靈為主的苯并咪唑類殺菌劑來防治小麥赤霉病，并且取得很好的成效。然而，近年來，禾谷鐮孢菌對(duì)苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性問題日益突出，多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的防治效果顯著下降。研究發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮孢菌β2微管蛋白不同氨基酸位置的點(diǎn)突變是產(chǎn)生對(duì)多菌靈抗藥性的主要原因

2、。
　　β2微管蛋白167位點(diǎn)突變不僅能導(dǎo)致禾谷鐮孢菌對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)也會(huì)使禾谷鐮孢菌的DON毒素產(chǎn)量增加，不僅降低了小麥的品質(zhì)，還導(dǎo)致人和動(dòng)物中毒。目前毒素合成的途徑已被闡明，但是毒素合成的調(diào)控方式仍不明確。前期研究表明，β2微管蛋白不同氨基酸位置的點(diǎn)突變對(duì)DON毒素的調(diào)控是間接的，并且與己糖激酶基因Fghxk的表達(dá)有關(guān)。同時(shí)，β2微管蛋白167位點(diǎn)突變還導(dǎo)致了丙酮酸含量的上調(diào)，這與DON毒素產(chǎn)量上調(diào)的結(jié)果一致。因此，為

3、了探究丙酮酸是否參與β2微管蛋白不同氨基酸位置的點(diǎn)突變對(duì)DON毒素的調(diào)控，我們探索了丙酮酸以及丙酮酸的合成與代謝與DON毒素的關(guān)系。
　　首先，我們通過外源添加丙酮酸探究了外源丙酮酸與DON毒素的關(guān)系。我們選取野生型敏感菌株和實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)的抗藥性菌株以及己糖激酶的敲除突變體作為研究的材料。研究發(fā)現(xiàn)，通過丙酮酸含量的測(cè)定，在誘導(dǎo)的抗藥性菌株中丙酮酸的含量顯著高于敏感菌株2021，這與前期毒素的產(chǎn)量趨勢(shì)一致。通過外源添加丙酮酸，無論是禾

4、谷鐮孢菌的離體產(chǎn)毒還是活體產(chǎn)毒，DON毒素的合成能力都顯著提高。同時(shí)，研究表明，與不添加丙酮酸的菌株相比，添加丙酮酸的菌株Tri家族基因的表達(dá)量顯著提高。在致病力的實(shí)驗(yàn)中，外源的丙酮酸能夠促使禾谷鐮孢菌對(duì)小麥的侵染，我們推測(cè)可能是由于外源丙酮酸刺激了毒素的合成從而間接誘導(dǎo)了致病力的提高。這些結(jié)果表明，外源的丙酮酸能夠影響毒素的合成，參與了毒素合成的調(diào)控。
　　探索了外源丙酮酸與DON毒素之間的關(guān)系，我們隨后在菌株內(nèi)部加強(qiáng)丙酮酸的合

5、成來進(jìn)行進(jìn)一步的研究。前期研究表明，己糖激酶是糖酵解途徑中合成丙酮酸的關(guān)鍵催化酶，在禾谷鐮孢菌中由Fghxk和FghxkR控制合成，其中Fghxk是主要的編碼基因。因此我們構(gòu)建了己糖激酶Fghxk的過表達(dá)突變體進(jìn)一步探索丙酮酸與產(chǎn)毒之間的關(guān)系。研究表明，F(xiàn)ghxk的過表達(dá)突變體菌絲生長(zhǎng)稍微緩慢，氣生菌絲顯著減少，表明Fghxk的過表達(dá)能夠影響菌絲的生長(zhǎng)。Fghxk基因過表達(dá)突變體對(duì)殺菌劑和各種細(xì)胞壁毒劑的敏感性均無變化，但對(duì)離子滲透壓的

6、抗性增強(qiáng)。基因表達(dá)分析表明Fghxk基因過表達(dá)能顯著增強(qiáng)Tri家族基因的表達(dá)。DON毒素含量測(cè)定也表示過表達(dá)Fghxk基因能夠增強(qiáng)DON毒素的合成能力。碳源利用測(cè)定表明過表達(dá)Fghxk基因會(huì)減弱禾谷鐮孢菌對(duì)果糖的利用。以上結(jié)果表明，F(xiàn)ghxk基因過表達(dá)能夠影響禾谷鐮孢菌形態(tài)學(xué)表型和DON毒素的合成。
　　丙酮酸主要通過丙酮酸脫氫酶復(fù)合體進(jìn)行分解代謝，在生物體中扮演著重要角色?；虮磉_(dá)量分析表明在田間多菌靈抗性菌株中，丙酮酸脫氫酶復(fù)

7、合體中Fg1at1的表達(dá)量顯著提高，因此接下來的研究主要通過敲除Fg1at1蛋白來進(jìn)一步探索丙酮酸與DON產(chǎn)毒之間的關(guān)系。研究表明，無論是野生型2021菌株還是田間抗性菌株167，敲除Fg1at1均能顯著影響菌絲生長(zhǎng)，并且菌絲呈黃色。在滲透壓敏感性方面，F(xiàn)g1at1敲除突變體對(duì)KCl和LiCl表現(xiàn)更敏感而對(duì)NaCl表現(xiàn)抗性，說明了Fg1at1可能與K+和Li+的運(yùn)輸有關(guān)。然而，F(xiàn)g1at1敲除突變體則表現(xiàn)出多殺菌劑多菌靈和細(xì)胞壁毒劑的抗