抑癌基因甲基化及抑癌基因和DNA甲基化酶表達水平與燃煤型砷中毒關(guān)系的研究.pdf

1、目的：流行病學(xué)研究證明，由于環(huán)境、職業(yè)和治療性原因使人類長期暴露于砷及其化合物，皮膚、膀胱及呼吸系統(tǒng)等部位的腫瘤發(fā)病率明顯增高。燃煤型砷中毒是由于長期使用砷含量高于100mg/kg的煤，高砷煤釋放出大量的砷污染糧食、辣椒和室內(nèi)空氣，通過飲食與呼吸大量的砷蓄積體內(nèi)，而造成的慢性砷中毒。本研究在現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上，通過檢測燃煤型砷中毒病人外周白細胞抑癌基因p16、p15、RASSF1A啟動區(qū)的甲基化，并對抑癌基因和DNA甲基化酶(DN

2、MT)的表達水平進行研究，探討燃煤型砷中毒對抑癌基因甲基化及抑癌基因和DNA甲基化酶表達水平的影響，為進一步研究砷致癌的分子機制提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 ⑴應(yīng)用現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查方法，對貴州燃煤型砷中毒病區(qū)的病人、病區(qū)對照和病區(qū)外對照進行流行病學(xué)調(diào)查。
　　 ⑵運用甲基化特異性PCR方法(Methylation-specific PCR，MSP)，檢測外周白細胞抑癌基因p16、p15、RASSF1A啟動區(qū)的甲

3、基化狀況，分析影響抑癌基因甲基化的相關(guān)因素。
　　 ⑶運用RT-PCR方法，檢測外周白細胞抑癌基因p16、p15、RASSF1A的RNA轉(zhuǎn)錄水平，分析影響抑癌基因轉(zhuǎn)錄水平的影響因素。
　　 ⑷運用RT-PCR方法，檢測外周白細胞DNMT1、DNMT3A、DNMT3B的RNA轉(zhuǎn)錄水平，分析影響DNMT轉(zhuǎn)錄水平的影響因素。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分燃煤型砷中毒對抑癌基因甲基化的影響。
　　 ⑴抑癌

4、基因p16、p15、RASSF1A啟動區(qū)的甲基化率病例組顯著高于內(nèi)、外對照組，并呈現(xiàn)隨砷中毒病情增加的趨勢(P＜0.01)。
　　 ⑵經(jīng)對性別、年齡、民族、居住年限、文化程度、吸煙、飲酒等進行的單因素分析表明其不是影響抑癌基因p16、p15甲基化的因素；而年齡是影響RASSF1A基因甲基化的因素，RASSF1A基因甲基化人群與非甲基化人群平均年齡比較有顯著性差異，甲基化人群平均年齡顯著大于非甲基化人群(P＜0.05)。
　

5、　 ⑶多元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，p16、p15基因甲基化的主要影響因素是砷中毒程度，其標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)(b')分別是2.189和1.956，P值分別為0.000和0.001。隨著砷中毒程度加深，p16、p15基因甲基化率增加。RASSF1A基因甲基化的主要影響因素是砷中毒程度和年齡，其標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)(b')分別為1.776和1.068，P值分別為0.014和0.037，隨著砷中毒程度加深和年齡增加，RASSF1A甲基化率增加。<

6、br>　　 第二部分燃煤型砷中毒對抑癌基因表達水平的影響。
　　 ⑴抑癌基因p16和RASSF1A的轉(zhuǎn)錄水平外對照組、內(nèi)對照組、砷中毒輕度、中度、重度中毒組之間總體有顯著性差異(P＜0.05)，隨砷中毒程度加深，抑癌基因p16和RASSF1A的轉(zhuǎn)錄水平降低；抑癌基因p15的轉(zhuǎn)錄水平總體無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 ⑵經(jīng)對性別、民族、居住年限、文化程度、吸煙、飲酒等進行的單因素分析表明其不是影響抑癌基因p16、p

7、15和RASSF1A轉(zhuǎn)錄水平的因素。年齡與p16轉(zhuǎn)錄水平無相關(guān)關(guān)系(P＞0.05);年齡與p15轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)關(guān)系，隨年齡增大p15轉(zhuǎn)錄水平升高(P＜0.05)；年齡與RASSF1A轉(zhuǎn)錄水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，隨年齡增大RASSF1A轉(zhuǎn)錄水平降低(P＜0.01)。
　　 ⑶多元線性回歸分析結(jié)果顯示，p16轉(zhuǎn)錄水平的主要影響因素是砷中毒程度和文化程度，其標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)(b')分別是-0.191和0.144，P值為分別為0.010和0.0

8、50，隨著砷中毒程度加深，p16轉(zhuǎn)錄水平顯著降低；而文化程度高的研究對象其p16轉(zhuǎn)錄水平更高，說明文化程度對砷中毒引起的p16轉(zhuǎn)錄水平降低可能是一個保護因素；p15轉(zhuǎn)錄水平的主要影響因素是年齡，其標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)(b')是0.159，P值為0.033，隨著年齡的增高，p15轉(zhuǎn)錄水平顯著升高；RASSF1A基因轉(zhuǎn)錄水平的主要影響因素是砷中毒程度和年齡，其標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)(b')分別是-0.313和-0.169，P值為0.000和0.017，隨著砷

9、中毒程度加深和年齡增大，RASSF1A轉(zhuǎn)錄水平顯著降低。
　　 第三部分燃煤型砷中毒對DNMT表達水平的影響。
　　 ⑴DNMT1和DNMT3B的轉(zhuǎn)錄水平外對照組、內(nèi)對照組、砷中毒輕度、中度、重度中毒組之間總體有顯著性差異(P＜0.01)，隨砷中毒程度加深，DNMT1和DNMT3B的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高；DNMT3A的轉(zhuǎn)錄水平總體無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 ⑵經(jīng)對性別、年齡、民族、居住年限、文化程度、吸煙、

10、飲酒等進行的單因素分析表明吸煙是影響DNMT1轉(zhuǎn)錄水平的因素(P＜0.01)，吸煙者DNMT1轉(zhuǎn)錄水平顯著高于不吸煙者；年齡與DNMT3B轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)關(guān)系，隨年齡增大， DNMT3B轉(zhuǎn)錄水平升高(P＜0.05)。
　　 ⑶多元線性回歸分析結(jié)果顯示，砷中毒程度是影響DNMT1和DNMT3B轉(zhuǎn)錄水平的主要因素，其標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)(b')分別是0.358和0.390，P值均為0.000，隨著砷中毒程度加深，DNMT1和DNMT3B轉(zhuǎn)錄

11、水平顯著升高。按P＜0.05顯著水平，與DNMT3A轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)的影響因素?zé)o一能進入多元線性回歸模型中。
　　 第四部分研究結(jié)果的綜合分析。
　　 ⑴抑癌基因甲基化及轉(zhuǎn)錄水平和DNMT轉(zhuǎn)錄水平三者之間的單因素分析結(jié)果。抑癌基因p16、p15和RASSF1A甲基化人群其基因轉(zhuǎn)錄水平顯著低于非甲基化人群(P＜0.05)，抑癌基因的高甲基化可能影響基因的表達，使其轉(zhuǎn)錄水平降低。抑癌基因p16、RASSF1A甲基化人群其DNMT

12、3A和DNMT3B轉(zhuǎn)錄水平顯著高于非甲基化人群(P＜0.05)，DNMT表達的升高可能造成抑癌基因的高甲基化。抑癌基因p16轉(zhuǎn)錄水平與DNMT3B轉(zhuǎn)錄水平之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，隨著DNMT3B水平升高，抑癌基因p16轉(zhuǎn)錄水平降低；抑癌基因RASSF1A轉(zhuǎn)錄水平與DNMT1轉(zhuǎn)錄水平之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.05)，隨著DNMT1水平升高，抑癌基因RASSF1A轉(zhuǎn)錄水平降低。說明DNMT活性的升高可能引起抑癌基因的高甲基化，

13、間接引起抑癌基因表達下降。
　　 ⑵影響抑癌基因甲基化及轉(zhuǎn)錄水平和DNMT轉(zhuǎn)錄水平三者的多因素分析綜合考慮抑癌基因甲基化及轉(zhuǎn)錄水平和DNMT轉(zhuǎn)錄水平三者之間的聯(lián)系后進行的多元Logistic回歸分析和多元線性回歸分析結(jié)果顯示如下：砷中毒程度是抑癌基因p16、p15和RASSF1A甲基化的主要影響因素，隨著砷中毒程度的加深，抑癌基因甲基化增加；另外DNMT3B轉(zhuǎn)錄水平也是影響p16甲基化的主要因素之一，而年齡是影響RASSF1A甲

14、基化的主要因素之一。砷中毒程度和文化程度是p16轉(zhuǎn)錄水平的主要影響因素，其回歸系數(shù)(b’)分別是-0.210和0.149，說明隨著砷中毒程度加深，p16轉(zhuǎn)錄水平逐漸降低；而文化程度高的研究對象其p16轉(zhuǎn)錄水平更高，文化程度可能對砷中毒引起的轉(zhuǎn)錄水平下降是一個保護因素。p15甲基化和DNMT3A轉(zhuǎn)錄水平是p15轉(zhuǎn)錄水平的主要影響因素，其標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)(b')分別是-0.195和0.160，說明隨著p15甲基化升高，p15轉(zhuǎn)錄水平降低；而隨著

15、DNMT3A轉(zhuǎn)錄水平增高p15轉(zhuǎn)錄水平也增高。砷中毒程度和年齡是RASSF1A轉(zhuǎn)錄水平的主要影響因素，其標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)(b')分別是-0.313和-0.169，說明隨著砷中毒程度加深和年齡增大，RASSF1A轉(zhuǎn)錄水平逐漸降低。砷中毒程度是DNMT1和DNMT3B轉(zhuǎn)錄水平的主要影響因素，隨著砷中毒程度加深，DNMT1和DNMT3B轉(zhuǎn)錄水平升高。另外p16甲基化也是DNMT3B轉(zhuǎn)錄水平的影響因素，p16甲基化高的研究對象其DNMT3B轉(zhuǎn)錄水平

16、也高。
　　 結(jié)論：
　　 ①燃煤型砷中毒是抑癌基因p16、p15、RASSF1A啟動區(qū)高甲基化的主要影響因素，并隨著砷中毒程度加深，甲基化率顯著升高。
　　 ②燃煤型砷中毒是抑癌基因p16和RASSF1A轉(zhuǎn)錄水平的主要影響因素，并隨著砷中毒程度加深，轉(zhuǎn)錄水平顯著下降；p15轉(zhuǎn)錄水平無顯著變化。
　　 ③燃煤型砷中毒是DNMT1和DNMT3B轉(zhuǎn)錄水平的主要影響因素，并隨著砷中毒程度加深，轉(zhuǎn)錄水平顯著升高；

17、DNMT3A轉(zhuǎn)錄水平無顯著變化。
　　 ④抑癌基因p16、p15和RASSF1A甲基化人群其基因轉(zhuǎn)錄水平顯著低于非甲基化人群，抑癌基因甲基化可能影響基因轉(zhuǎn)錄水平。
　　 ⑤抑癌基因p16、RASSF1A甲基化人群的DNMT3A和DNMT3B轉(zhuǎn)錄水平顯著高于非甲基化人群，DNMT表達升高可能是造成抑癌基因高甲基化的因素之一。
　　 ⑥抑癌基因p16轉(zhuǎn)錄水平與DNMT3B轉(zhuǎn)錄水平之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，抑癌基因 RASS