攜帶IBV基因重組質(zhì)粒的大腸桿菌發(fā)酵及提取工藝研究.pdf

1、本研究以本課題組構(gòu)建的攜帶禽傳染性支氣管炎病毒真核表達質(zhì)粒(pcDNA-S1、pcDNA-M、pcDNA-N)的重組大腸桿菌為研究對象，對其發(fā)酵工藝進行了研究。　　采用單因子分析和正交設(shè)計，對重組大腸桿菌的搖瓶發(fā)酵工藝進行了研究，優(yōu)化了裝液量、培養(yǎng)溫度、初始pH等培養(yǎng)條件，搖瓶發(fā)酵后，以堿裂解法提取質(zhì)粒產(chǎn)量可達46.5mg/L，是未優(yōu)化前質(zhì)粒產(chǎn)量的6.8倍?！　⊙芯苛藬y帶禽傳染性支氣管炎病毒真核表達質(zhì)粒基因工程菌在20L發(fā)酵罐中的發(fā)

2、酵工藝。進行了分批發(fā)酵和補料發(fā)酵。結(jié)果表明，補料發(fā)酵在菌體量和質(zhì)粒產(chǎn)量上均有增加。通過補料發(fā)酵，每小時補加80ml補料培養(yǎng)基，菌體密度(OD600)可達到43，以堿裂解法提取質(zhì)粒產(chǎn)量達到76mg/L。所得質(zhì)粒產(chǎn)量是分批發(fā)酵產(chǎn)量的1.6倍。與LB培養(yǎng)基相比，菌體濃度和質(zhì)粒產(chǎn)量分別提高了40倍和27倍?！　Πl(fā)酵液用熱激法和堿裂解法兩種不同提取方法進行粗提，再用聚乙二醇和硅藻土兩種方法進行純化，并對純化條件進行了優(yōu)化，建立了以堿裂解法粗提

3、，硅藻土法純化的質(zhì)粒DNA提純工藝。該工藝可去除大部分RNA、基因組DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，提取的質(zhì)粒DNA純度可達到1.88，超螺旋比例達到98.4％，符合世界衛(wèi)生組織關(guān)于質(zhì)粒產(chǎn)質(zhì)量要求。完成整個操作只需90分鐘，比PEG法純化節(jié)省了5個小時。對發(fā)酵罐發(fā)酵的菌體以本工藝提純，質(zhì)粒產(chǎn)量可達到100mg/L。與離子交換法比較，生產(chǎn)成本降低了50％?！　”狙芯拷档土嘶蚬こ叹l(fā)酵和質(zhì)粒提取的生產(chǎn)成本，為DNA疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)提供了理論和實驗