瘤胃產甲烷菌定量檢測與微生物菌群調控研究.pdf

1、瘤胃甲烷的生成不僅是飼料能量的損失,而且通過暖氣排入大氣的甲烷是一種重要的溫室氣體。隨著全球對溫室氣體排放的重視,反芻動物瘤胃甲烷生成受到越來越多的關注。本研究在建立分子生物學手段檢測瘤胃產甲烷菌及微生物菌群的基礎上,通過探討不同調控途徑對瘤胃產甲烷菌和微生物菌群的影響,研究產甲烷菌和微生物菌群與甲烷生成的密切關系。首先利用實時定量PCR方法,建立瘤胃產甲烷菌及微生物菌群的檢測技術(第一部分);然后利用產甲烷菌選擇性抑制劑研究產甲烷菌與

2、微生物菌群的變化(第二部分),并以天然調控劑茶皂素為調控手段探討其對產甲烷菌及瘤胃微生態(tài)的影響(第三部分);最后模擬高粗日糧條件,探討甲烷生成與瘤胃微生態(tài)的關系(第四部分)。
　　 第一部分瘤胃產甲烷菌及微生物菌群分子研究方法的建立
　　 建立實時定量PCR方法檢測瘤胃內產甲烷菌、原蟲以及主要的纖維降解微生物,并建立產甲烷菌活性檢測手段。以產甲烷短桿菌屬的模式菌種——反芻獸甲烷短桿菌(Methanobrevibacter

3、 ruminantium)為研究對象,建立實時定量PCR絕對定量法。研究發(fā)現(xiàn),熒光定量PCR方法(y)與傳統(tǒng)計數(shù)法(x)對產甲烷菌的定量結果強相關,y=1.0152x-3×108(r=0.9753;P＜0.01)。而后利用反轉錄Real Time PCR檢測mcrA基因表達,表征產甲烷菌的活性。添加2-溴乙烷磺酸(BES)后,反芻獸甲烷短桿菌mcrA基因表達受抑制,培養(yǎng)30小時后其表達量僅為對照組的1％;而添加2,4-二羥基蝶呤(Lum

4、azine)后,mcrA基因表達在前6小時內升高,而后逐漸下降。采用實時定量PCR方法定量分析混合培養(yǎng)微生物中產甲烷菌及主要的纖維降解微生物結果表明,各菌標準曲線可信度高,擴增效率相近(98.4-99.9％)。體外培養(yǎng)24小時后,BES處理組的產甲烷菌顯著減少(P＜0.01),僅為對照組的10.3％;BES處理組的真菌數(shù)量雖然隨著培養(yǎng)時間的增加而增長,但其量明顯受抑制,在培養(yǎng)12小時和24小時后分別減少40.0和61.9％;甲烷抑制組的

5、產琥珀酸絲狀桿菌增加50％,而黃化瘤胃球菌數(shù)量無明顯變化。
　　 本部分研究結果表明,實時定量PCR方法可以準確定量瘤胃微生物,實踐中可根據試驗目的選用絕對定量法或相對定量法。
　　 第二部分不同抑制劑對瘤胃產甲烷菌及微生物菌群的調控
　　 以混合培養(yǎng)微生物為研究對象,探討不同的選擇性抑制劑(BES,Lumazine或Mevinolin(甲基四氫蝶呤))對甲烷生成和產甲烷菌的調控作用。研究表明,體外培養(yǎng)24小時后

6、,三種抑制劑對甲烷生成、產甲烷菌含量以及產甲烷菌活性產生不同的影響。BES和Lumazine顯著降低了甲烷生成量,分別為對照組的17.2％和83.8％,Mevinolin對甲烷生成量無顯著影響。BES和Lumazine顯著降低了產甲烷菌的含量,分別為對照組的42.2％和60.0％。Mevinolin對產甲烷菌沒有顯著影響。培養(yǎng)24小時后,BES顯著抑制了產甲烷菌的活性,僅為對照組的1％。Lumazine組mcrA基因表達量在前12小時有

7、所下降,24小時后比對照組高19％。Mevinolin組mcrA基因表達量在前12小時內無顯著變化,24小時后比對照組高45％。DGGE結果表明,抑制劑降低了某些優(yōu)勢產甲烷菌的代謝活性。三種抑制劑顯著提高了原蟲數(shù)量,BES、Lumazine和Mevinolin組的原蟲數(shù)較對照組分別提高42.3％、65.3％和27.5％。BES顯著降低了真菌數(shù)量(P＜0.05),為對照組的71.9％,Lumazine和Mevinolin提高了真菌數(shù)量(P

8、＜0.05),分別較對照組提高43.8％和37.5％。BES增加產琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量(P＜0.05),降低黃色瘤胃球菌數(shù)量;Lumazine降低兩種纖維降解菌數(shù)量;Mevinolin降低產琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量(P＜0.05),增加黃色瘤胃球菌的數(shù)量(P＜0.05)。PCR-DGGE結果表明,16S rRNA擴增子獲得的條帶較16S rDNA擴增子獲得條帶數(shù)更多,說明混合微生物中代謝活性微生物菌群與微生物優(yōu)勢菌群的組成不同,而且BES和L

9、umazine對代謝活性微生物區(qū)系的影響更大。
　　 直接作用于甲烷生成途徑的BES和Lumazine對產甲烷菌、mcrA基因表達和微生物區(qū)系的影響更大,Mevinolin影響產甲烷菌細胞壁的合成,其作用效果不如前二者明顯。
　　 第三部分茶皂素對產甲烷菌及瘤胃微生物菌群的調控效果研究
　　 研究茶皂素對瘤胃微生物菌群、產甲烷菌數(shù)量與活性和純培養(yǎng)反芻獸甲烷短桿菌的影響,探討茶皂素降低瘤胃甲烷生成的作用機理。研究表

10、明,茶皂素減少原蟲數(shù)量,添加0.2和0.4 mg/ml的茶皂素組中原蟲數(shù)量分別減少了51.2％和22.9％(P＜0.05)。產甲烷細菌的數(shù)量并未受茶皂素的影響(P＞0.05),表明甲烷產生并不完全對應于產甲烷菌的數(shù)量變化。在混合培養(yǎng)微生物中,茶皂素顯著抑制了混合培養(yǎng)微生物的mcrA基因表達,茶皂素處理組的mcrA基因表達較對照組降低了76％。以反芻獸甲烷短桿菌為研究對象,發(fā)現(xiàn)茶皂素對瘤胃內優(yōu)勢產甲烷菌——反芻獸甲烷短桿菌無明顯抑制作用。

11、
　　 這些結果表明,茶皂素可以抑制原蟲,從而抑制甲烷的生成。茶皂素對瘤胃內主要產甲烷菌沒有直接影響,推測茶皂素通過抑制原蟲作用影響氫氣生成量,間接降低產甲烷菌活性。產甲烷菌活性,即mcrA基因表達可以更好地預測復雜微生態(tài)系統(tǒng)中甲烷生成的變化規(guī)律。
　　 第四部分高粗日糧對瘤胃產甲烷菌及微生物菌群的調控研究
　　 試驗采用不同纖維來源及水平的NDF模擬高粗日糧條件下瘤胃的發(fā)酵模式,比較不同來源及水平的NDF對瘤胃

12、產甲烷菌及微生物菌群的影響。不同來源的NDF對甲烷生成及產甲烷菌產生了顯著影響,苜蓿NDF組與全株玉米青貯NDF組的產甲烷菌區(qū)系類似,相似性指數(shù)為93.3％;黑麥草與黑麥草青貯NDF組區(qū)系的相似性指數(shù)為87.1％。體外培養(yǎng)24小時后,NDF來源、水平及兩者的互作對產甲烷菌產生極顯著影響(P＜0.01);苜蓿NDF與淀粉以60∶40組合時,產甲烷菌數(shù)量最低;100％黑麥草為培養(yǎng)底物時,產甲烷菌數(shù)量最高。產甲烷菌與甲烷生成呈負相關關系。不同

13、水平黑麥草青貯NDF對優(yōu)勢產甲烷菌影響不大,產甲烷菌相似性指數(shù)在91.1％到96.6％之間;但不同水平NDF影響了微生物區(qū)系,其相似性指數(shù)降到46％～72％。
　　 甲烷生成量與產甲烷菌和兩種纖維降解菌呈負相關關系,與原蟲無相關性。產甲烷菌與真菌呈正相關關系(P=0.0099),與其他菌不存在顯著相關關系。
　　 綜上所述,通過分析產甲烷菌數(shù)量及其mcrA基因表達,可以預測瘤胃內甲烷的生成;產甲烷菌數(shù)量與原蟲數(shù)不完全相關