延胡索酸二鈉對山羊瘤胃甲烷生成的調(diào)控研究及相關(guān)瘤胃微生物菌群分析.pdf

1、反芻動物瘤胃甲烷的排放，既意味著可被動物消化能量的損失，又導致了大氣中溫室氣體的增加，因此減緩瘤胃甲烷生成已經(jīng)越來越引起人們的重視。延胡索酸是瘤胃中的重要中間代謝產(chǎn)物，可作為電子受體用于抑制甲烷生成。本論文系統(tǒng)研究了延胡索酸二鈉調(diào)控瘤胃甲烷生成的微生物學機理及延胡索酸還原菌的多樣性。首先建立了檢測瘤胃微生物代謝產(chǎn)物中的有機酸含量的高效液相色譜分析方法，為分析瘤胃微生物的代謝狀況提供了可靠的分析手段;其次研究了在不同精粗比條件下添加延胡索

2、酸二鈉對山羊血清生化指標、甲烷生成、瘤胃發(fā)酵、瘤胃微生物區(qū)系組成及重要微生物數(shù)量的影響，從多個角度揭示了延胡索酸二鈉調(diào)控瘤胃甲烷生成的機理;再就是利用編碼延胡索酸還原酶的功能基因frdA基因研究了瘤胃延胡索酸還原菌的多樣性;利用體外繼代培養(yǎng)結(jié)合16S rRNA克隆庫的方式研究了可培養(yǎng)延胡索酸利用菌在體外繼代培養(yǎng)過程中的變化規(guī)律;最后通過厭氧滾管技術(shù)分離到兩株延胡索酸還原菌并對其進行了形態(tài)學、生理生化特性以及16S rRNA序列鑒定。本研

3、究試驗共分為五個部分:
　　 1、建立高效液相色譜法檢測瘤胃微生物代謝產(chǎn)物中的有機酸
　　 建立了一種同時快速分析瘤胃微生物發(fā)酵液中7種有機酸的高效液相色譜法。該方法采用色譜級甲醇和20 mM磷酸氫二鈉緩沖液（用磷酸調(diào)pH至2.7，v∶v=1∶99）作為流動相，流速采用二元泵梯度程序洗脫方法控制，紫外檢測波長為215n，柱溫為30℃，能夠快速、準確地分離和測定瘤胃微生物發(fā)酵液中的甲酸、乙酸、丙酸、延胡索酸、琥珀酸、蘋果酸

4、、乳酸。方法的回收率為96.40％～99.60％，相對標準偏差為1.50％～4.40％，各種有機酸的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9993，具有較高的精密度和準確度，可以用于瘤胃微生物發(fā)酵液中的有機酸分析。
　　 2、不同精粗比條件下添加延胡索酸二鈉對山羊血清生化指標、甲烷生成、瘤胃發(fā)酵、微生物區(qū)系組成及重要微生物數(shù)量的影響
　　 選用4只體重約為24±1.43kg、裝有永久瘺管的本地雜交閹公羊，采用2×2兩因子析因設(shè)計，按一個

5、4×4拉丁方排序，以日糧精粗比（粗料:精料分別為41∶59或57.6∶42.4）和延胡索酸二鈉添加量（0 g/天或10g/天）作為主要影響因子，研究不同精粗比條件下添加延胡索酸二鈉對山羊血清生化指標、瘤胃發(fā)酵、甲烷生成、微生物區(qū)系組成及重要菌群數(shù)量變化的影響。結(jié)果顯示，日糧精粗比和延胡索酸二鈉對血糖、甘油三酯、膽固醇、尿素氮、乳酸的濃度以及谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶的酶活無顯著影響，說明添加延胡索酸對山羊健康沒有明顯影響。與未添

6、加延胡索酸二鈉的對照組相比，添加延胡索酸二鈉顯著降低了甲烷產(chǎn)量（P＜0.05），飼喂高精料和高粗料日糧的山羊甲烷產(chǎn)量分別降低了8.10％、15.76％。與未添加延胡索酸二鈉的對照組相比，飼喂延胡索酸二鈉組的山羊瘤胃內(nèi)總揮發(fā)性脂肪酸、乙酸、丙酸濃度顯著增加（P＜0.05）。DGGE分析結(jié)果表明，不同日糧精粗比條件下添加延胡索酸二鈉對瘤胃細菌及甲烷菌區(qū)系組成沒有顯著影響;飼喂延胡索酸二鈉的山羊瘤胃內(nèi)的產(chǎn)甲烷菌數(shù)量要低于未添加延胡索酸二鈉組（

7、P＜0.05）。添加延胡索酸二鈉組中的反芻獸新月形單胞菌（一種延胡索酸還原菌）的數(shù)量要顯著高于未添加延胡索酸二鈉的對照組，但僅限于高粗料條件下（P＜0.05）。日糧精粗比與延胡索酸二鈉之間對于反芻獸新月形單胞菌的影響存在顯著交互作用(P＜0.05)。真菌、原蟲、黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量不受延胡索酸二鈉添加劑量的影響。日糧的精粗比的變化對于產(chǎn)甲烷菌、真菌和黃化瘤胃球菌影響顯著（P＜0.05），但是對甲烷產(chǎn)量（g/天）無顯著影響

8、。這結(jié)果提示延胡索酸二鈉對山羊瘤胃發(fā)酵具有有益作用，結(jié)果也進一步提示延胡索酸二鈉的效果不是直接作用于真菌、原蟲和主要的纖維降解菌，而是由于它促進了延胡索酸還原菌的生長，抑制了產(chǎn)甲烷菌的生長。其中一些指標的變化，如反芻獸新月型單胞菌的數(shù)量等，與日糧精粗比的變化相關(guān)，這說明了延胡索酸二鈉對甲烷的抑制效果可能與日糧的精粗比相關(guān)。
　　 3、利用frdA基因研究延胡索酸還原菌的多樣性
　　 雖然瘤胃延胡索酸還原菌對于降低甲烷生成

9、可能具有重要作用，但是目前關(guān)于在山羊瘤胃內(nèi)的延胡索酸還原菌的多樣性的研究卻仍不清楚。本研究利用構(gòu)建延胡索酸還原酶frdA基因克隆庫的方式來分析多種日糧條件下（高精料或高粗料，精粗比分別為41∶59或57.6∶42.4，兩種日糧均添加0或10 g/天延胡索酸二鈉）山羊瘤胃內(nèi)Proteobacteria門延胡索酸還原菌的多樣性。RFLP分析結(jié)果表明206個陽性克隆可分為24個分類操作單元(OTU)，表明延胡索酸還原菌的多樣性非常高;frdA

10、擴增序列所推導的氨基酸與已知氨基酸序列的相似性范圍為75％～93％，這意味著瘤胃內(nèi)存在許多未知的延胡索酸還原菌。它們均屬于Proteobacteria;系統(tǒng)進化樹分析表明，這些序列在遺傳距離上相距較遠。
　　 4、體外繼代培養(yǎng)研究山羊瘤胃延胡索酸利用菌的變化規(guī)律
　　 采用PCR-DGGE結(jié)合16S rRNA克隆庫技術(shù)，研究了山羊瘤胃內(nèi)容物中延胡索酸利用菌菌群在體外傳代過程中的變化規(guī)律。PCR-DGGE的分析結(jié)果表明，隨

11、繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，細菌DGGE圖譜上的條帶數(shù)逐漸變少，一些條帶(A、B、C、E、F、G、H)消失，一部分一直存在(D、O、P、Q、R、S)，而部分條帶明顯得到富集(I、J、K、L、M、N)。繼代培養(yǎng)5次后細菌條帶數(shù)趨于穩(wěn)定。16Sr RNA基因測序比對結(jié)果表明，所獲得的88個克隆中，6個克隆屬于Fusobacterium varium（相似性＞97％），占克隆的6.82％;42個克隆屬于Wolinella succinogenes（相

12、似性＞97％），占克隆的47.73％;4個克隆屬于Clostridium cochlearium（相似性＞97％），占克隆的4.55％;10個克隆屬于Bacteroides pyogenes（相似性＞97％），占克隆的11.36％;8個克隆屬于Agrobacterium tumefaciens（相似性＞97％），占克隆的9.09％;2個克隆屬于Oribacterium sinus（相似性＜97％），占克隆的2.27％;3個克隆屬于Clo

13、stridiumsubterminale(相似性＞97％)，占克隆的3.41％;3個克隆屬于Fusobacterium naviforme（相似性＜97％），占克隆的3.41％;10個克隆屬于Clostridium hastiforme(相似性＞97％)，占克隆的11.36％。系統(tǒng)進化樹分析表明，它們分別屬于Clostridiales、Fusobacteriales、Rhizobiales、Campylobacterales、Bacte

14、roidales。以上結(jié)果說明，混合瘤胃內(nèi)容物中存在大量的延胡索酸利用菌，它們可能會參與瘤胃延胡索酸還原過程，添加延胡索酸可起到體外富集延胡索酸還原菌的作用。
　　 5、山羊瘤胃延胡索酸利用菌的分離、鑒定
　　 通過厭氧滾管法從健康山羊瘤胃內(nèi)容物中分離得到了兩株瘤胃厭氧細菌，分別命名為Y1和Y10。經(jīng)HPLC法檢測它們對延胡索酸二鈉的代謝情況可知，它們都能夠利用延胡索酸生成琥珀酸并進一步形成丙酸。經(jīng)形態(tài)學和生理生化特性分

15、析，初步鑒定Y1屬于埃希氏菌屬，Y10屬于變形桿菌屬。將兩株菌的16 S rRNA序列與GenBank中的已知序列相比較，其與Escherichia coli、 Proteus mirabilis的相似性高達99％，進一步確定所分離到的菌株Y1為埃希氏菌屬弗氏埃希氏菌（Escherichia fergusonii），Y10為奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)。經(jīng)RDP數(shù)據(jù)庫分類比較，它們均屬于變形桿菌（Proteobac