基于RNAi技術(shù)的BnFAE1基因沉默及對甘藍(lán)型油菜芥酸合成的影響.pdf

1、芥酸是十字花科特有一種22碳超長鏈脂肪酸,廣泛存在于十字花科蕓薹屬植物種子中。芥酸本身不僅不易被人體消化吸收、營養(yǎng)價(jià)值低,而且它在脂肪酸所占比例較大也直接制約其它有益的脂肪酸的含量。因此,低芥酸已成為國際上食用油的重要品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)和遺傳改良的重要目標(biāo)。油菜中芥酸合成是在脂肪酸延長酶(FAE1)及其它酶的協(xié)同下,催化油酰-CoA以丙二酰輔酶A為碳源經(jīng)過兩個(gè)相繼的縮合反應(yīng),先行合成C20:1△11,隨后一步生成芥酸(C22:1△13)。其中,由

2、FAE1基因編碼的β-酮酯酰-CoA合酶催化第一步(縮合)反應(yīng),是芥酸合成中的關(guān)鍵酶。
　　 本實(shí)驗(yàn)依據(jù)依據(jù)植物RNA干擾的原理和研究中用于構(gòu)建RNAi載體的基本經(jīng)驗(yàn),選擇fael(GenBanK:AY577313)基因的1147-440區(qū)間的序列(498bp)分別以反向和正向的形式插入到含有種子特異性表達(dá)的啟動子和終止子的載體中,并在反向和正向插入的基因片段之間即間隔區(qū)導(dǎo)入一個(gè)來源于豌豆rbcS-3C intron(83bp)

3、片段,然后通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將正、反向重復(fù)序列整合到植物的基因組中,這樣由反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄形成的mRNA就會經(jīng)互補(bǔ)配對導(dǎo)致發(fā)卡狀RNA(hpRNA)的形成,由此形成的dsRNA誘導(dǎo)發(fā)生RNAi,進(jìn)而誘發(fā)內(nèi)源fae1轉(zhuǎn)錄的mRNA發(fā)生降解。
　　 經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜Y015,獲得19株陽性植株。半定量RT-PCR檢測FAE1基因表達(dá),fae1基因的沉默效果均十分明顯,FAE1表達(dá)下調(diào)62-98％。從T1、T3兩代之間FAE1的

4、沉默效應(yīng)可以看出,RNAi介導(dǎo)的FAE1基因沉默效應(yīng)可以在兩代之間穩(wěn)定遺傳。進(jìn)一步的脂肪酸檢測分析,芥酸含量只相當(dāng)于對照芥酸含量的0.5～41.62％,減少58.38-95.50％；C20脂肪酸也有了明顯的降低趨勢,減少51.19-89.51％,芥酸含量的降低與FAE1酶的抑制成明顯的一致關(guān)系。與此同時(shí),轉(zhuǎn)基因植株的油酸、亞油酸等脂肪酸含量比對照相應(yīng)均有顯著增加,油酸含量增加11.44～36.23％、亞油酸含量增加54.90～104.6