農(nóng)桿菌介導白芥防御素基因轉入甘藍型油菜的研究.pdf

1、油菜(Brassica napus L．)屬于十字花科蕓苔屬，是世界四大油料作物之一，在全球產(chǎn)量中處于第三位，僅次于大豆和棕櫚油。近年來，真菌等病害造成了油菜產(chǎn)量和品質的大幅下降，而消除病害所需要的農(nóng)藥投入巨大，同時造成了嚴重的環(huán)境污染。如能通過對油菜進行轉基因改良，使其自身具有良好的抗病害能力，將具有重要的經(jīng)濟價值和環(huán)保意義。 植物防御素(Plant defensins)是一種存在于多種植物中的小分子(45-54氨基酸)堿性多

2、肽。其保守的含有8個Cys，而形成4個二硫鍵。因其與動物防御素同源而得名。植物防御素具有廣譜高效的抗微生物活性，能有效的殺滅G+、G、某些真菌、螺旋體、被膜病毒等微生物，而對植物細胞沒有傷害，是植物先天性非特異性免疫的重要組成部分。2005年羅勤等從十字花科植物白芥種子中成功地克隆了編碼植物防御素的基因，在原核表達載體GTK中對白芥防御素基因進行了融合表達，并通過花序浸染法轉入擬南芥中進行表達，以研究防御素基因功能。 本研究以甘

3、藍型優(yōu)質高產(chǎn)雜交油菜新品種“蜀雜九號"恢復系材料84100-18(Brassica napus L)為實驗材料，以下胚軸為外植體，通過根癌農(nóng)桿菌EHA-105的介導，將其攜帶的白芥防御素基因(Sad)轉入油菜中，經(jīng)共培養(yǎng)、抗生素篩選、生根獲得了高抗性轉化植株。對所獲得的轉化植株進行了PCR檢測結果表明，外源的Sad基因已經(jīng)整合入油菜基因組中。論文還對影響農(nóng)桿菌介導法轉化效率的主要因素進行了分析討論。主要實驗結果如下： 1.通過對比觀察外

4、植體的誘導及分化情況，建立并優(yōu)化了油菜植株的再生體系。試驗表明：下胚軸的分化頻率高于子葉且離生長點0.5-1cm的下胚軸切段最高；菌液稀釋至OD<,600>0.5，浸泡時間1min，共培養(yǎng)2d；農(nóng)桿菌再懸浮液與共培養(yǎng)基中加入20mg/L 乙酰丁香酮可提高轉化頻率：AgNO<,3>可提高下胚軸芽的分化率；MS+2mg/L6-BA+1mg/L 2，4-D時芽的分化率最高；卡那霉素起始選擇濃度為10mg/L。 2.用含有Sad基因的植

5、物表達載體pBI121-Sad的根癌農(nóng)桿菌轉化油菜，對各項轉化條件進行優(yōu)化，確定了農(nóng)桿菌EHA105轉化油菜外植體的最佳條件。確定用植株再生的最佳培養(yǎng)基分別為：Ⅰ無菌苗培養(yǎng)基：MS基本培養(yǎng)基Ⅱ預共培養(yǎng)基：MS+2mg/L 6-BA+Img/L 2，4-D+2.5mg/LAgN03+19.62mg/L.AsⅢ篩選培養(yǎng)基：MS+2mg/L 6-BA+2.5mg/LAgNO<,3>+500mg/L Carb+1.0mg/L KanⅣ生根快繁培