香蕉嗜鐵內(nèi)生細菌BEB3的分離鑒定及其生防機理初探.pdf

1、本試驗從中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所香蕉種質(zhì)圃的19份香蕉種質(zhì)中分離得到71份香蕉內(nèi)生細菌,其中GCTCV106和TMBX1378兩份種質(zhì)內(nèi)生菌含量最高,均達到1×106 cfu/g,最少的臺蕉3號也有1×104 cfu/g。經(jīng)過體外活性評價,篩選出對香蕉枯萎病4號生理小種(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC4)具有一定拮抗作用的內(nèi)生細菌分離物6份,占總分離物的8.45％,其中一株BEB3

2、拮抗效果最好。經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化及16S rDNA分子鑒定,確定該菌為勞爾氏菌屬(Ralstonia sp.),與Ralstonia mannitolilytica(甘露醇羅爾斯頓菌)相似性最高達99.6％。
　　 采用利福平梯度誘導(dǎo)篩選,獲得BEB3抗利福平200μg/ml的突變株。通過接合轉(zhuǎn)移將帶有GFP基因的自殺性質(zhì)粒pJBA28轉(zhuǎn)到BEB3菌株中,挑選能在雙抗平板上生長的克隆子,經(jīng)PCR檢測、熒光共聚焦觀察和South

3、ern雜交分析,獲得陽性克隆子。用浸根的方法對香蕉組培苗進行回接,分別提取種植10 d、20 d、30 d的香蕉沙床苗的DNA,用PCR進行檢測,發(fā)現(xiàn)帶有GFP標記的BEB3菌株已經(jīng)定殖在香蕉植株內(nèi)。
　　 用CAS固體平板檢測發(fā)現(xiàn)BEB3產(chǎn)鐵載體,并對該菌進行了發(fā)酵條件的優(yōu)化。通過單因素實驗和正交優(yōu)化實驗確定,該菌的最佳生長發(fā)酵培養(yǎng)基(1L)為:4 g葡萄糖,4g酸水解酪蛋白,0.5 ml的1 mol/L MgCl2,1 ml

4、的1 mol/L CaCl2。而產(chǎn)鐵載體的最佳培養(yǎng)基為:1 g葡萄糖,1 g酸水解酪蛋白,0.5 ml/L的1 mol/L MgCl2,1 ml/L的1 mol/LCaCl2。綜合發(fā)酵成本、該菌生長量及鐵載體產(chǎn)量可知,該菌較優(yōu)的培養(yǎng)條件為:150 ml三角瓶中裝液50 ml,起始pH6.5,接種量7％,起始鐵離子濃度0.4 mg/L。
　　 對內(nèi)生菌BEB3抗病性評價的初步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):該菌的無菌濾液對鐮刀菌孢子萌發(fā)和菌絲的生長