玉米內(nèi)生生防細(xì)菌的分離鑒定與遺傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、玉米是世界上最重要的糧食作物之一，玉米紋枯病是一種土傳性真菌病害，近年來已發(fā)展成為玉米上最嚴(yán)重的病害之一，導(dǎo)致玉米嚴(yán)重減產(chǎn)、質(zhì)量不佳。傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)防治見效甚緩，化學(xué)防治雖效果好見效快，但長期使用化學(xué)藥劑容易帶來一系列環(huán)境問題，破壞生態(tài)平衡的同時(shí)還容易導(dǎo)致病菌的耐藥性。目前尚無高抗該病的玉米品種，常規(guī)抗病育種將抗性基因轉(zhuǎn)入玉米中，雖能獲得較好的防治效果，但由于單一抗性基因的長期使用會導(dǎo)致病原菌新小種的出現(xiàn)，使抗性品種失去抗性。而生防微生物因

2、為繁殖速度快，不易使病原菌產(chǎn)生耐藥性、對環(huán)境安全無害等特點(diǎn)，具有較好的應(yīng)用前景。為提高玉米對紋枯病的抗病能力，本研究從玉米中分離對紋枯病菌有一定拮抗作用且對植物本身無害的內(nèi)生細(xì)菌來進(jìn)行生物防治，并通過遺傳轉(zhuǎn)化的方法構(gòu)建出含目的基因的工程菌株，為防治紋枯病的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)?，F(xiàn)已獲得了如下研究成果:
　　1.通過玉米組織表面消毒法和平板稀釋分離法，從采集的玉米樣品中共分離到內(nèi)生細(xì)菌70株，其中根部24株，葉片22株，葉鞘13株，莖

3、桿11株。
　　2.通過室內(nèi)平板對峙試驗(yàn)與離體葉片接病篩選試驗(yàn)，獲得了4株對玉米紋枯病菌表現(xiàn)出一定拮抗作用的菌株LV-A、LV-B、LV-8和LV-12。
　　3.通過常規(guī)的形態(tài)觀察、部分生理生化特性測定與16SrDNA鑒定相結(jié)合的方法，對4株細(xì)菌進(jìn)行了初步鑒定，鑒定LV-A、LV-B、LV-8均為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，LV-12為熒光假單胞菌（Pseudomonasfluor

4、escens）。
　　4.通過多克隆位點(diǎn)和Kana抗性表達(dá)盒的連入，構(gòu)建了假單胞菌-大腸桿菌穿梭載體pInaQ-Kana，并用化學(xué)轉(zhuǎn)化法成功地轉(zhuǎn)入熒光假單胞菌野生型菌株LV-12中。
　　5.擴(kuò)增Kana抗性表達(dá)盒的啟動子和來自于水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)的無毒基因avrRxo1，依次連入載體pInaQ-Kana中，構(gòu)建了表達(dá)載體pInaQ-PKana-avrRxo1-K