駿棗內(nèi)生細(xì)菌的分離、鑒定與拮抗菌的篩選.pdf

1、目的：
　　 本研究以交城駿棗為實(shí)驗(yàn)材料，用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和克隆文庫構(gòu)建的方法研究交城駿棗內(nèi)生細(xì)菌種群多樣性;找出一組較適合應(yīng)用于植物內(nèi)生細(xì)菌分離的培養(yǎng)基;并篩選出能夠拮抗多種植物病原菌和人體致病菌的內(nèi)生細(xì)菌。
　　 方法：
　　 1、培養(yǎng)基的選擇:對(duì)分離內(nèi)生細(xì)菌的常用培養(yǎng)基，如胰酶大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、任氏培養(yǎng)基(R2A)、金氏培養(yǎng)基B(KMB)、肉汁胨培養(yǎng)基(BPA)、LB培養(yǎng)基、酵母膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(Y

2、PM)、無氮培養(yǎng)基進(jìn)行選擇，以使其能最大限度的分離大棗中的內(nèi)生細(xì)菌。
　　 2、內(nèi)生細(xì)菌的分離及鑒定:采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離出紅棗的內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其形態(tài)特征和主要生理生化特性，如接觸酶、氧化酶、淀粉水解、硝酸鹽還原、吲哚反應(yīng)、V-P實(shí)驗(yàn)、耐鹽性、最高耐受溫度等進(jìn)行測(cè)定。通過16SrDNA序列測(cè)定結(jié)果結(jié)合生理生化特征對(duì)內(nèi)生細(xì)菌做出初步鑒定。
　　 3、拮抗菌的篩選:采用平板對(duì)峙法篩選出多種對(duì)植物病原菌和人體致病菌有抑菌活性的

3、內(nèi)生細(xì)菌。
　　 4、克隆文庫的方法研究成熟健康大棗內(nèi)生細(xì)菌的多樣性:①表面滅菌;②大棗基因組DNA的提取;③PCR擴(kuò)增并切膠純化;④克隆建庫;⑤酶切分型;⑥代表?xiàng)l帶的測(cè)序;⑦多樣性分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、將大棗組織稀釋到104-106倍較適合內(nèi)生菌的分離，本實(shí)驗(yàn)選擇的7種分離培養(yǎng)基中KMB培養(yǎng)基和無氮培養(yǎng)基分離內(nèi)生菌的效果最好。
　　 2、采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法從紅棗中分離到16株內(nèi)生細(xì)菌和2株內(nèi)生真

4、菌，經(jīng)初步鑒定，細(xì)菌包括芽孢桿菌（Bacillussp.）、Lysinibacillus菌（Lysinibacillussp.）、葡萄球菌(Staphylococcussp.)、多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）、紅球菌(Rhodococcussp.)、庫克菌(Kocuriasp.)、節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)、微球菌（Micrococcussp.）、不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp.)。

5、
　　 3、通過對(duì)峙實(shí)驗(yàn)從紅棗內(nèi)生細(xì)菌中篩選出5株對(duì)多種植物病原真菌和人體致病菌有拮抗作用的細(xì)菌，分別為不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp.)、節(jié)桿菌(Arthrobactersp.)、Lysinibacillus菌（Lysinibacillussp.）、多粘類芽孢桿菌（Paenibacilluspolymyxa）。
　　 4、構(gòu)建克隆文庫，得到陽性克隆151個(gè)，劃分為15個(gè)OTUs（操作分類單元），經(jīng)過16SrD

6、NA片段測(cè)序，有42個(gè)克隆屬于大腸桿菌(E.coli)，代表了3個(gè)OTUs，在該文庫中占總克隆數(shù)的27.8％。有28個(gè)克隆屬于蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)，代表了2個(gè)OTUs，在該文庫中占總克隆數(shù)的18.5%。有23個(gè)克隆屬于類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)，代表了3個(gè)OTUs，在該文庫中占總克隆數(shù)的15.2%。這三個(gè)類屬于該克隆文庫的優(yōu)勢(shì)種群。
　　 結(jié)論：
　　 1、紅棗內(nèi)分布有大量內(nèi)生