兩株香蕉內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及其對香蕉枯萎病的生防效果評價.pdf

1、本研究從香蕉枯萎病(BananavasicularWilt)重病園區(qū)，生長正常的香蕉假莖內(nèi)分離獲得兩個菌株B215和E353。通過離體拮抗測定和對小苗生防效果評價，確認(rèn)B215、E353對香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense，F(xiàn)OC)具有良好的生防作用。其次在確定兩菌株分類地位的基礎(chǔ)上對其培養(yǎng)條件、定殖狀況、致病性、拮抗機(jī)理等做初步研究。結(jié)果如下： 1、通過組織研磨法從香蕉假莖內(nèi)分離出B215

2、和E353兩個菌株，通過對峙培養(yǎng)和孢子萌發(fā)抑制初步測定，B215、E353對香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉彎孢霉葉斑病菌、香蕉鏈格孢葉斑病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均具有良好拮抗效果。B215培養(yǎng)液濾液使香蕉4種病菌真菌分生孢子和菌絲畸變膨大成球狀或串珠狀，其EC50分別為4.12％、5.14％、6.16％和5.96％。E353培養(yǎng)液濾液使香蕉4種病菌真菌分生孢子，致畸膨大成絮狀或串珠狀，其EC50分別為4.57％、6.14％、4.48％和

3、7.59％。 2、通過形態(tài)學(xué)特征、生理生化和16SrDNA序列測定，對篩選的兩株拮抗細(xì)菌B215、E353進(jìn)行了鑒定。 形態(tài)特征、生理生化試驗顯示，B215菌落乳白色，革蘭氏染色陽性，石蕊牛奶不產(chǎn)酸。淀粉水解、硝酸鹽還原反應(yīng)、明膠液化均為陽性。氧化酶反應(yīng)為陰性。可以在含7％NaCl和pH5.7的NA培養(yǎng)基上生長。根據(jù)這些特征，按照《芽孢桿菌屬》相關(guān)的分類檢索表，將B215鑒定為芽孢桿菌(Bacillus)。E353菌落淡

4、黃色，具有波狀或珊瑚形的邊緣。革蘭氏染色陰性。對紅霉素敏感。硝酸鹽還原、果膠水解均為陽性。明膠液化、淀粉水解均為陰性。不能在7％NaCl和pH5.7的培養(yǎng)基上生長。按照《植物病原細(xì)菌學(xué)》、《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》鑒定手冊相關(guān)的分類檢索表，將E353鑒定為歐文氏菌(Erwinia)。 利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增兩個菌株16SrDNA序列并測序，將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)絡(luò)上搜索、比對，結(jié)果顯示，B215的16SrDNA序列與已報道的枯草芽孢桿

5、菌(Bacillussubtilis)相應(yīng)序列具有100％的同源性，二者在所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上處于同一個分支；E353與已報道的歐文氏菌屬菊歐氏桿菌(Erwiniachrysanthemi)相應(yīng)序列具有99％以上的同源性，在構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹上與菌株距離最近。 根據(jù)上述形態(tài)特征、生理生化和16SrDNA序列分析結(jié)果，將B215鑒定為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)，將E353鑒定為歐文氏菌屬菊歐氏桿菌(Erwiniachrys

6、anthemi)。 3、兩株拮抗內(nèi)生菌對香蕉枯萎病的生防效果評價，通過室內(nèi)平板對峙培養(yǎng)、分生孢子萌發(fā)抑制懸滴法，菌株傳代的拮抗穩(wěn)定性測定，并在優(yōu)化兩個菌株的培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行溫室小苗試驗。 對峙培養(yǎng)顯示，B215明顯抑制香蕉枯萎病菌菌絲生長，抑菌帶寬度為0.5～0.6cm。B215培養(yǎng)液濾液使FOC分生孢子和菌絲變形，分生孢子和菌絲生長點(diǎn)膨大成球狀或串珠狀畸形,原生質(zhì)外泄，細(xì)胞崩潰干癟。B215從第1代到第40代的培

7、養(yǎng)液濾液抑制FOC孢子的EC50大小差異很小，在4.12％～5.39％之間波動。 E353與FOC對峙培養(yǎng)形成的抑菌帶寬度為0.8～1.0cm，E353培養(yǎng)液濾液使FOC分生孢子致畸膨大成絮狀。E353轉(zhuǎn)管傳代40次，其培養(yǎng)液濾液抑制FOC的EC50在4.55％～5.36％之間波動。 在NA培養(yǎng)基上，獲得B215最佳培養(yǎng)條件：裝液量為50mL/500mL，最適初始pH值為7.0～7.5，初始接菌量為1％，培養(yǎng)溫度為28℃

8、;E353最佳培養(yǎng)條件：裝液量為100mL/500mL，初始pH值為7.0，初始接菌量為1％，培養(yǎng)溫度為30℃。在優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，通過正交設(shè)計優(yōu)化溫室盆栽試驗，結(jié)合土壤中殘余的FOC數(shù)量，在接種一定數(shù)量FOC(5×106cfu/mL)時，得出菌株B215、E353對FOC生防的最佳組合均為：在小苗定植前，用活菌培養(yǎng)液(750mL/株)浸根，可以降低小區(qū)的FOC發(fā)病率。進(jìn)一步的試驗結(jié)果顯示：盆缽試驗B215、E353對FOC的防

9、效分別為62.95％和60.67％。 4、通過灌根傷根和針刺等植株體外接種方法，檢測菌株在香蕉假莖內(nèi)的定殖力，同時測定拮抗菌株對香蕉植株的致病性。同時經(jīng)過不同的溫度和酸堿度處理后，對菌株培養(yǎng)液濾液的理化性質(zhì)做初步研究。 菌株B215、E353均可在香蕉假莖內(nèi)定殖且時間持續(xù)25d以上，對香蕉植株無致病性。菌株回收后通過拮抗性測定、形態(tài)特征鑒定、16SrDNA序列與原始菌株的序列分析比對等證明菌株在香蕉假莖具有內(nèi)生定殖力。