大白菜抗根腫病基因CRq的精細(xì)定位及克隆.pdf

1、大白菜根腫病是由根腫菌屬根腫菌侵染十字花科植株的根部引起的,該病有著十字花科作物的“癌癥”之稱。因此,挖掘抗病基因,培育抗病品種,對(duì)大白菜根腫病研究具有十分重要的意義。本研究在實(shí)驗(yàn)室以大白菜抗病DH系Y635-10和感病DH系Y177-47作為研究親本,構(gòu)建F2分離群體,利用BSA-Seq和RNA-Seq對(duì)根腫病抗病基因CRq進(jìn)行精細(xì)定位的基礎(chǔ)上,對(duì)CRq進(jìn)行了克隆,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體,對(duì)擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,并對(duì)

2、轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了抗病性鑒定,主要得到以下結(jié)果:
　　1.在河南省農(nóng)科院園藝所新野縣根腫病實(shí)驗(yàn)基地對(duì)構(gòu)建的F2分離群體進(jìn)行春、秋兩季的抗病性鑒定試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)F2分離群體的抗病、感病植株的分離比例約為3∶1,根據(jù)孟德爾遺傳定律對(duì)抗性鑒定結(jié)果進(jìn)行分析,判斷大白菜根腫病抗性為一個(gè)主效基因控制。
　　2.在F2分離群體表型鑒定的基礎(chǔ)上,依據(jù)抗病、感病的表型的差異,選取極端抗、感表型的個(gè)體及親本,構(gòu)建2個(gè)測(cè)序深度為10x的親本DNA池和

3、2個(gè)測(cè)序深度為50x的F2分離群體極端抗、感DNA池,進(jìn)行BSA-Seq分析,將抗性基因初步定位于A03染色體的24.30-24.75區(qū)域(450Kb)。通過(guò)加密標(biāo)記的方式,在該區(qū)域設(shè)計(jì)了298個(gè)SSR標(biāo)記和365個(gè)InDel標(biāo)記,將候選區(qū)間精細(xì)到24.30-24.55Mb(250Kb)。
　　3.結(jié)合大白菜的參考基因組數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)存在4個(gè)抗病基因,之后將4個(gè)R基因序列與RNA-Seq時(shí)親本De novo組裝數(shù)據(jù)比對(duì)分析,

4、發(fā)現(xiàn)這4個(gè)R基因均比對(duì)到了抗病材料Y635-10中組裝的Unigene16741。因此,推測(cè)Unigene16741可能是大白菜抗根腫病基因CRq的部分片段,并利用RACE技術(shù)克隆CRq基因cDNA全長(zhǎng)。
　　4.利用Gateway技術(shù)構(gòu)建CRq基因的植物過(guò)表達(dá)載體,對(duì)擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,并對(duì)T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行抗病性鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在根腫菌侵染處理后,與轉(zhuǎn)基因植株相比,野生型擬南芥的根部明顯膨大,說(shuō)明轉(zhuǎn)基因擬南芥具有一定抗性。因