大白菜抗霜霉病同源基因的克隆與分析.pdf

1、大白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)原產(chǎn)我國(guó),其栽培面積及產(chǎn)量均居我國(guó)蔬菜之首。霜霉病是大白菜三大病害之一,嚴(yán)重影響大白菜的產(chǎn)量和品質(zhì),因此,抗霜霉病育種一直是大白菜的重要育種目標(biāo)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,克隆并利用植物的抗性基因,研究這些基因的結(jié)構(gòu)和功能已成為生物技術(shù)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本研究以大白菜自交系‘85-1’的BAC文庫(kù)為材料,應(yīng)用同源序列法篩選抗病同源基因的BAC克隆,對(duì)獲得的10個(gè)陽(yáng)性

2、克隆進(jìn)行酶切分析,構(gòu)建了亞克隆文庫(kù),并對(duì)篩選的陽(yáng)性亞克隆進(jìn)行了測(cè)序分析。本試驗(yàn)的研究結(jié)果如下:
　　 1.根據(jù)植物抗霜霉病基因保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,利用三步PCR方法對(duì)大白菜‘85-1’BAC文庫(kù)進(jìn)行篩選,從19200個(gè)BAC克隆中篩選到含有目的基因的10個(gè)陽(yáng)性克隆。對(duì)10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行NotⅠ酶切,經(jīng)脈沖場(chǎng)電泳檢測(cè),10個(gè)克隆的插入片段在80-100kb之間。將10個(gè)陽(yáng)性克隆分別用EcoRⅠ、BamHⅠ及HindⅡ酶切,電泳檢測(cè)

3、酶切結(jié)果,由酶切圖譜顯示,選擇陽(yáng)性克隆94-G-17和限制性內(nèi)切酶HindⅡ建立亞克隆文庫(kù)。
　　 2.含抗霜霉病同源基因的亞克隆文庫(kù)含有6200個(gè)克隆,覆蓋BAC克隆的180倍左右。隨機(jī)挑取85個(gè)亞克隆進(jìn)行EcoRⅠ,PstⅠ雙酶切,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),其中78個(gè)克隆酶切后均有插入片段,其大小基本分布在1-5kb之間,平均插入片段大小為3kp左右。7個(gè)克隆酶切后只有載體片段,無(wú)插入片段,空載率為8.36％。
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